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外界环境与不同方药对CIA大鼠证候及T细胞亚型漂移影响的比较研究

周刚  
【摘要】: 类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因不明的慢性、进展性、自身免疫性疾病。其病理特征为单核细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳形成,以及软骨侵蚀和关节破坏。临床表现为关节对称性疼痛、运动障碍、甚至关节强直畸形致残,以及多脏器受累。目前RA的具体发病机制尚不清楚,多数学者认为,RA是由遗传与环境因素共同作用而引起的一种自身免疫性疾病。 RA在中医学属痹证范畴。“痹”字最早见于《黄帝内经》,其病因据“风寒湿三气杂至”及“邪之所凑,其气必虚”的理论,为“内外合邪”所致。张仲景秉承《内经》之旨,开痹证辨证论治之先河,后世医家多遵从《内经》及《金匮要略》之论痹,结合各自所处历史环境与个人临床经验,从不同角度深入对痹证病因病机的认识,并立法组方遣药,或配以针灸、导引等外治法,使痹证证治丰富多彩,各具特色。而治痹方药之组成、配伍,以及方药之寒热温凉等属性,只有与痹证之“证候要素”、“病机”高度相符,该方药才能获得最佳疗效。这即是痹证“方证相应”理论的研究内容,也是痹证临床辨治的客观要求。 为观察外界环境对痹证证候的影响,验证痹证乃“内外合邪”的病因学理论,并研究治痹方药与痹证证型的相关性及该相关性的生物学内涵,本课题以RA目前最为公认的动物模型,即Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型作为热痹证大鼠模型,采用“人工气候”试验箱进行外界环境的“风寒湿”或“风湿热”干预,再选用治疗热痹证的代表方剂——宣痹汤以及治疗寒热错杂痹证的代表方剂——桂枝芍药知母汤进行交叉治疗干预,进行了有关痹证病因学理论以及痹证“方证相应”理论的动物实验研究。 1.实验用Ⅱ型胶原在Wistar大鼠诱导CIA模型。在二次免疫后,即从第2周开始,M(模型)组大鼠非致炎足(左足)出现炎性改变,其临床体征与人RA体征相似,血清Anti-CII、IgG抗体以及INF-γ、IL-4、TNF-a等细胞因子显著升高,踝关节H-E染色观察发现典型的RA炎症性改变。综合体征及微观生物学指标,可认为CIA造模成功,热痹证模型建立。 2.在CIA造模成功的基础上,采用“人工气候”试验箱,对模型大鼠“风寒湿”(C组)或“风湿热”(H组)干预三周,定量分析大鼠舌象,并观察宏观体征。结果显示,C组大鼠可辨为寒痹证;H组大鼠仍可辨为热痹证,但兼夹瘀血因素。与M组比较,C组IgG抗体、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均显著下降,Anti-CII抗体亦下降,H组IgG抗体、INF-γ、IL-4水平显著下降,TNF-a水平亦下降,Anti-CII抗体水平未见明显改变;流式细胞术结果显示,C组Th1、Th1/Th2均显著降低,H组仅见Th1/Th2下降,Th1、Th2所占淋巴细胞比率无明显变化;荧光实时定量(Real-time)PCR技术测定显示,C组T-bet mRNA表达下调,IL-4 mRNA表达显著上调,C组和H组INF-γmRNA表达均下调,差异均具有显著性,但T-bet/GATA-3比值两组均无统计学改变;关节H-E染色后观察显示,H组与M组相似,均病变重,C组病变较轻,偶见炎症细胞浸润。综合宏观体征和微观指标分析表明,“风寒湿”和“风湿热”均能改善Th1/Th2漂移,其中“风寒湿”改善更为明显,但二者对T-bet/GATA-3比值均无明显影响。 3.采用同样的实验技术,对M组CIA大鼠灌胃给予宣痹汤(X组)及桂枝芍药知母汤(G组)三周后显示,两组大鼠血清IgG抗体、INF-γ、IL-4、TNF-a水平均降低,Th1、Th1/Th2均显著降低,Th2显著上升,T-bet、INF-γmRNA表达显著下调,IL-4 mRNA表达显著上调,T-bet/GATA-3在G组有改变,在X组明显改变。H-E染色显示,G组病变仍较重,X组偶见炎症细胞,病变减轻。此外,使用缺口末端标记法(TUNEL)原位检测关节组织细胞凋亡显示,两组细胞凋亡率均明显下降,但X组更明显。综合宏观体征和微观指标,宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比,前者能更好地治疗CIA大鼠,逆转Th1/Th2漂移,下调T-bet/GATA-3比值。 4.同样,对“风寒湿”干预三周后的CIA大鼠,灌胃给予宣痹汤(C+X组)及桂枝芍药知母汤(C+G组)干预三周,结果显示,C+X组大鼠血清Anti-CII抗体水平显著上升,Th1,Th1/Th2亦显著上升,C+G和C+X组均见IL-4 mRNA表达明显下调,仅C+X组T-bet/GATA-3比值上调。关节HE染色后观察显示,C+X组炎症细胞大量浸润,与M组病变程度类似,而C+G组单核细胞浸润减少,病变减轻。TUNEL原位检测关节组织细胞凋亡显示,与C相比较,C+G组细胞凋亡率下降,C+X组未见明显改变,但镜下观察显示C+X组炎症细胞、纤维细胞增加,细胞凋亡加重。综合宏观体征和微观指标,宣痹汤与桂枝芍药知母汤均未明显改善经“风寒湿”干预三周的CIA大鼠病情,反而,宣痹汤使临床症状、关节局部病变,细胞凋亡恶化,且上调了T-bet/GATA-3比值,加剧了Th1/Th2漂移。 5.此外,对“风湿热”干预三周后的CIA大鼠,灌胃给予宣痹汤(H+X组)及桂枝芍药知母汤(H+G组)三周,结果显示,仅H+G组大鼠血清Anti-CII抗体水平显著下降,H+G组和H+X组Th1、Th1/Th2均显著降低,Th2显著上升,INF-γmRNA表达均下降,另外,仅H+G组GATA-3 mRNA表达上调,T-bet/GATA-3比值下降。关节HE染色后观察显示,H+G组与H组比较,病变减轻,而H+X组病变仍较重。TUNEL法原位检测关节组织细胞凋亡显示,两组细胞凋亡率均未明显改变。综合宏观体征和微观指标,宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比,在改善经“风湿热”干预三周后的CIA临床症状和微观指标方面,后者要优于前者。 综上,“风寒湿”或“风湿热”外界环境干预可导致热痹证CIA大鼠证候改变,并都能改善CIA热痹证大鼠的病情,逆转Th1/Th2漂移,但前者影响更为明显,后者对CIA大鼠关节局部病变无影响。这证明,外界环境对痹证证候演变有一定程度的影响,验证了痹证乃“内外合邪”的病因学理论。另外,宣痹汤与桂枝芍药知母汤相比,前者与热痹证大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符,能更好地治疗CIA热痹证,逆转Th1/Th2漂移,但与寒痹证CIA大鼠的“证候要素”、“病机”相反,使寒痹证大鼠病情恶化,加剧Th1/Th2漂移:桂枝芍药知母汤对寒痹证大鼠病情及Th1/Th2漂移影响不明显,但与热痹证兼夹瘀血因素大鼠的“证候要素”、“病机”更为相符,能更好改善该证型CIA大鼠病情,但二者对Th1/Th2漂移影响相似。这验证了痹证“方证相应”理论中,只有治痹方药与痹证证候之“要素”、“病机”高度相符,该方药才能获得最佳疗效的正确观点。而且,Th1/Th2细胞亚群漂移程度可能是痹证“方证相应”理论中“方”与“证”符合度在细胞水平的物质基础,T-bec/GATA-3 mRNA表达情况,可能是“方”与“证”符合度在分子水平的物质基础。


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