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阿片类物质心瘾形成相关证候及神经生物学机制研究

宋月晗  
【摘要】: 随着外源性阿片类物质滥用成为世界性公害,我国阿片类物质滥用人数也正在不断激增,阿片类药物成瘾是一种慢性反复发作性脑病,已成为目前社会及医学领域的一大问题,其戒断复杂而艰难。近二十年来大量学者对成瘾的机制、戒断方法等各个方面进行了深入的研究,因此实现脱毒并无困难,对脱毒后急性戒断综合征也形成了有效的综合治疗措施,稽延性戒断综合征中的躯体依赖症状也逐步实现了针对性治疗,目前考验戒毒工作的最大难题是阿片类物质引起的心理渴求,中医称之为“心瘾”,这是戒断后复发率高居不下的关键,目前现代医学和中医学均尚无有效的处理措施。 辨证论治是中医学的一个基本特点,辨证之所以重要就在于“证”是中医治疗的首要依据,在祖国医学几百年的戒毒医疗实践中,对心瘾的病因病机及辨证分型都有所记载,然而都只限于个人的经验探讨,尚无客观化研究成果,也未形成系统的理论体系,成为中医治疗心瘾的桎梏。 基于目前现代医学无药可治,中医学无证可辨的研究现状,本课题以阿片类物质心瘾立题,通过理论研究和实验客观研究相结合的方法对心瘾相关证候进行探讨,以期使阿片类物质心瘾有证可辨,辨证客观,对中医临床用药作出一定贡献。 论文分为理论研究和实验研究两部分:理论研究部分在大量文献分析基础上,综合运用演绎、类比、引证等方法,分别从脏腑失调和痰浊内停两个方面,对阿片类物质戒断症状的相关机制进行分析,深入探讨了阿片类物质心瘾相关病机及证候。实验部分结合既往研究,采用以方测证的方法对理论结论进行验证,各个证型针对方是结合大量临床证候学调查,将课题组所用的临床有效方虎门合剂化裁而成,分为四个组方,补肾方、疏肝方、养心方和化痰方。继而在病证结合研究思路的指导下,对阿片类物质心瘾模型中各个证型的神经生物学机制进行研究,现代研究表明伏核、前额叶皮质是心瘾形成密切相关脑区,其突触可塑性变化是心瘾的根本病机,因此本实验对心瘾形成相关证候与两脑区突触可塑性相关蛋白的关系为切入点探讨相关证候的病理基础。 研究一阿片类物质成瘾形成相关证候的理论研究 理论研究一从脏腑功能失调论阿片类物质成瘾 方法:本研究通过大量古代及现代文献分析,运用归纳法将阿片类物质成瘾所导致的各类急性戒断症状和稽延性戒断症状与脏腑功能失调的关系进行分析,发现各类症状中,仅对心瘾尚未提出当从何脏腑论治。因此以心瘾形成的核心机制“动机异常”为切入点,结合大量文献研究,采用类比法、演绎法对阿片类物质心瘾形成与脏腑失调的关系进行深入探讨。结果:阿片类物质心瘾形成是“肝主疏泄”、“肝司谋虑”、“肾藏志”等肝肾功能失调的结果。结论:阿片类物质心瘾作为一种情志疾病,其形成的核心证候基础为“肝失疏泄”,也与肾之阴阳不足相关。 理论研究二痰浊内阻与阿片类物质成瘾的关系 方法:结合文献研究,对“痰”的产生机制、致病特性进行探讨,并采用类比法、演绎法对“痰”这一病理产物与阿片类物质心瘾持续顽固存在的关系进行探讨。结果:“痰”是在疾病发展进程中形成的一种病理产物,同时又作为一种致病因素对疾病产生影响,阿片类物质心瘾持续顽固的特性与“痰”的致病特点极为吻合。结论:痰浊的形成是阿片类物质依赖发展到一定程度的结果,“痰”是心瘾持续顽固的主要病因。 以此为基础提出本研究的理论结论:阿片物质成瘾中各类急性戒断症状和稽延性戒断症状分别与不同脏腑的功能失调相关,其中阿片类物质心瘾形成核心相关证候为“肝失疏泄”,与肾阴阳两虚也密切相关;另外,当阿片类物质成瘾发展到一定阶段会导致痰浊内停,成为心瘾持续顽固的证候基础。在实验研究中,对心瘾形成相关证候进一步验证,并探讨的其病理机制。 研究二阿片类物质心瘾形成相关证候及神经生物学基础研究 实验研究一阿片类物质心瘾动物模型的优化和评价 方法:本研究在条件位置偏爱经典模型的基础上,结合本实验室的NODULE公司行为学研究装置建立了条件位置偏爱自动观察分析系统,根据非倾向性实验设计的原理采用非自然偏爱箱白箱为伴药箱,并在本实验室条件下,分别采用5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg连续10天皮下注射吗啡的方法对大鼠进行条件位置训练50min,对照组大鼠仅注射生理盐水。训练结束后,进行条件位置偏爱测试15min。结果:条件位置偏爱自动观察分析系统对吗啡诱导的条件位置偏爱行为进行了实时记录和模式化分析,三种吗啡剂量训练50min均能使大鼠产生条件性位置偏爱,但相比之下,10mg/kg和15mg/kg的吗啡用量所产生的位置偏爱要更加明显,但15mg/kg的吗啡用量大鼠易激惹,且活动性差。结论:条件位置偏爱自动观察系统对吗啡诱导的条件位置偏爱行为进行实时记录和模式化分析,排除了非条件环境的干扰因素,具有精确、客观的优点,这在动物行为学观测中具有非常重要的意义。10mg/kg皮下注射为最佳吗啡诱导剂量,既能产生明显的条件位置偏爱效应,操作性也最强。在进一步的实验中,采用本实验心瘾模型的优化方案:非倾向性实验设计,皮下注射吗啡10mg/kg,训练时间为50min,连续造模10天,训练结束后进行测试15min,在自动观察系统中进行观察分析。 实验研究二以方测证探讨心瘾形成相关中医证候 方法:采用实验一的优化方案建立条件位置偏爱模型,结合所在课题组前期临床证候调查结果,将临床实践抗复吸有效方虎门合剂化裁为补肾方、疏肝方、化痰方和养心方,采用以方测证的方法,观察各个证型针对方对条件位置偏爱的改善作用,进而对理论结论中心瘾形成相关证候进行验证。结果:与心瘾模型组相比,补肾组和疏肝组大鼠在伴药箱中的停留时间显著下调(P<0.05),化痰组在伴药箱内的停留时间虽有下调趋势,但无显著差异,而养心组的大鼠在伴药箱的停留时间无变化。结论:补肾方、疏肝方对吗啡诱导的条件位置偏爱行为有所改善,养心方无显著改善,通过行为学进一步验证了理论结论,肝失疏泄、肾阴阳两虚是阿片类物质心瘾形成的证候基础。而化痰方表现出对条件位置偏爱行为有所改善但无显著差异的原因可能与造模的时间、造模的方式所代表的疾病进程有一定关系,有待进一步研究。 实验研究三心瘾形成相关中医证候与Syp的关系 方法:实验二中各组大鼠条件位置偏爱行为学测试结束后,随机选取8只进行免疫组织化学研究,随机选取5只左侧半脑进行Western blot研究,右侧半脑进行real timePCR研究,检测伏核、前额叶皮质两个脑区Syp的阳性反应物、蛋白表达量和mRNA表达水平。结果:免疫组化结果显示在前额叶皮质和伏核中,Syp免疫阳性产物呈棕黄色,分布在胞浆中,各组阳性反应物无显著差异。Western blot结果显示,与对照组相比,伏核中模型组Syp蛋白表达显著升高(P<0.05);前额叶皮质中Syp蛋白表达差异不具有显著性。与模型组相比,伏核中补肾组和疏肝组Syp蛋白表达显著下调(P<0.05),而前额叶皮质中Syp蛋白表达无显著差异。其它组方无显著调节作用。Real time PCR结果显示,与对照组相比,伏核和前额叶皮质中模型组Syp的mRNA表达均无显著差异。与模型组相比,伏核和前额叶皮质中,补肾组Syp的mRNA表达均无显著差异,伏核中疏肝组Syp的mRNA表达显著下调(P<0.05),前额叶皮质中疏肝组Syp的mRNA表达无显著差异。结论:在阿片类物质心瘾模型中,伏核中Syp的蛋白表达的上调与阿片类物质心瘾的形成相关。补肾方能显著下调Syp蛋白表达水平,而疏肝方则使其蛋白表达水平和mRNA表达水平均有显著下调,养心方和化痰方没有明显疗效。进一步验证了阿片类心瘾的形成在肝肾而不在心,也表明肝肾功能与高级中枢系统突触塑性密切相关,其失调的机制之一为伏核中与突触可塑性密切相关的Syp蛋白表达的异常,更深层次的机制有待进一步研究。 实验研究四心瘾形成相关中医证候与NMDA受体调节亚基的关系 方法:实验二中各组大鼠条件位置偏爱行为学测试结束后,随机选取8只进行免疫组织化学研究,随机选取5只左侧半脑进行Western blot研究,右侧半脑进行real timePCR研究,检测伏核、前额叶皮质两个脑区NMDA调节亚基NR2A、NR2B的阳性反应物、蛋白表达量和mRNA表达水平。结果:对NR2A,免疫组化和Western blot结果显示,在伏核和前额叶皮质中,模型组中NR2A免疫染色阳性神经元数及蛋白表达变化不显著,各个组方对NR2A的表达无显著调节作用。对于NR2B,免疫组化结果显示,与对照组相比,伏核和前额叶皮质中模型组NR2B阳性神经元数均显著上升(P<0.05)。与模型组相比,伏核中补肾组NR2B阳性神经元数显著下调(P<0.05),前额叶皮质中补肾组NR2B阳性神经元数无显著变化;与模型组相比,伏核和前额叶皮质中,疏肝组NR2B阳性神经元数显著下调(P<0.05)。其他组方无明显的调节作用。Western blot结果显示,与对照组相比,伏核中模型组NR2B蛋白表达极显著升高(P<0.01);前额叶皮质中NR2B蛋白表达显著升高(P<0.05)。与模型组相比,补肾组和疏肝组伏核和前额叶皮质中NR2B蛋白表达均显著下调(P<0.05),但与对照组相比,补肾组伏核中NR2B蛋白表达仍显著较高(P<0.05)。其它组方无显著调节作用。Real time PCR结果显示,与对照组相比,伏核中模型组NR2B的mRNA表达极显著升高(P<0.01),前额叶皮质mRNA表达也显著升高(P<0.05)。与模型组相比,伏核和前额叶皮质中疏肝组NR2B的mRNA表达显著下调(P<0.05)。其它组方无显著调节作用。结论:伏核和前额叶皮质中,NR2A调节亚基表达水平与阿片类物质心瘾的形成无显著相关,NR2B蛋白和基因水平的改变可能是阿片类物质心瘾形成的分子机制之一。在伏核和前额叶皮质中补肾方能显著下调NR2B蛋白表达水平,而疏肝方则使其蛋白表达水平和mRNA表达水平均有显著下调,再一次证明阿片类物质心瘾形成的主要病机是肝肾失调的同时,表明肝失疏泄的神经生物学本质与NR2B调节亚基在蛋白和基因水平的失调有关;肾阴阳不足的本质与NR2B蛋白表达水平的失调关系更为密切。 实验研究五心瘾形成相关中医证候与BDNF的关系 方法:实验二中各组大鼠条件位置偏爱行为学测试结束后,随机选取8只进行免疫组织化学研究,随机选取5只左侧半脑进行Western blot研究,右侧半脑进行real timePCR研究,检测伏核、前额叶皮质两个脑区BDNF的阳性反应物、蛋白表达量和mRNA表达水平。结果:免疫组化结果显示,与对照组相比,伏核中模型组BDNF阳性神经元数极显著升高(P<0.01),前额叶皮质中模型组BDNF阳性神经元数也显著升高(P<0.05)。与模型组相比,伏核和前额叶皮质中,补肾组和疏肝组BDNF阳性神经元数均显著下调(P<0.05),但与对照组比较,疏肝组伏核中BDNF神经元仍显著较高(P<0.05)。其他组方无显著调节作用。Western blot结果显示,与对照组相比,伏核和前额叶皮质中,模型组BDNF蛋白表达显著升高(P<0.01)。与模型组相比,伏核补肾组和疏肝组BDNF蛋白表达显著下调(P<0.05),而前额叶皮质中BDNF蛋白表达极显著下调(P<0.01)。Real time PCR结果显示,与对照组相比,伏核和前额叶皮质中模型组BDNF的mRNA表达均极显著升高(P<0.01)。与模型组相比,伏核和前额叶皮质中疏肝组BDNF的mRNA表达显著下调(P<0.05),但与对照组比较,前额叶皮质中BDNF mRNA表达仍显著升高(P<0.05)。结论:伏核和前额叶皮质中,BDNF蛋白表达和mRNA表达的升高均与阿片类物质心瘾的形成相关,表明BDNF蛋白和基因水平的改变可能是阿片类物质心瘾形成的分子机制之一。对于BDNF蛋白和基因水平的调节作用,在伏核和前额叶皮质中补。肾方能显著下调其蛋白表达水平,而疏肝方则使其蛋白表达水平和mRNA表达水平均有显著下调。表明“肝失疏泄”的神经生物学本质与BDNF在蛋白和基因水平的失调有关;肾阴阳不足的本质仅与BDNF蛋白表达水平的失调关系更为密切。结合对NR2B及Syp的研究,认为阿片类物质心瘾的中医病机主要责之于肝肾,因此本研究结果进一步扩展了肝肾的本质在现代神经生物学中的外延,在中枢神经系统内,肝失疏泄与动机系统的突触可塑性改变相关,本研究可见伏核和前额叶皮质中可塑性相关蛋白在基因和蛋白水平的失调;而肾虚则主要与前额叶皮质和伏核中突触可塑性相关指标在蛋白水平的失调有关。 本研究在经典条件位置偏爱模型的基础上,利用本实验室新引进的NODULE公司行为学研究装置建立自动化条件位置偏爱观察分析系统,从而减少了非条件环境因素对吗啡相关条件线索的干扰,对不同剂量吗啡引起的条件位置偏爱效应进行比较,从而结合现代行为学手段,使阿片类物质心瘾模型进一步优化。采用演绎法、类比法及引证法等对阿片类物质心瘾相关的证候进行理论研究,在此基础上,将临床抗戒断有效方虎门合剂化裁为四个证型针对方,进一步采用以方测证的方法进行了行为学验证,对阿片类物质心瘾形成相关证候提出:心瘾形成的主要证候基础是“肝失疏泄”,同时肾之阴阳不足对心瘾的形成也有重要影响。对阿片类物质心瘾的神经生物学本质进行了探讨,结合伏核、前额叶皮质的突触可塑性在阿片类物质心瘾与异常用药动机形成的关系,以及Syp、NR2B亚基和BDNF三个蛋白与突触可塑性、心瘾的关系,本研究认为阿片类物质心瘾的形成与伏核和前额叶皮质中NR2B和BDNF的基因和蛋白水平的升高,伏核中Syp的蛋白水平升高相关。在病证结合的研究思路指导下,对阿片类物质心瘾相关证候的神经生物学本质进行了探讨,本研究认为心瘾形成相关肝失疏泄证的现代生物学本质为Syp、NR2B和BDNF在蛋白和基因水平的失调引起的伏核和前额叶皮质的突触可塑性变化;而肾阴阳不足的本质则在于以上三个指标在蛋白水平失调引起的上述脑区突触可塑性变化。通过上述研究,本研究对肝肾本质有更进一步的认识,在既往研究将“肝肾同源于精血”推进到“肝肾同源于脑”的基础上,又进一步扩展到“肝肾同源于动机回路”。


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