针刺督脉学对帕金森病小鼠脑线粒体功能的影响

【摘要】： 帕金森病(Parkinson'sdisease, PD)是一种缓慢进展的中枢神经变性疾病。其临床主要表现为肢体震颤、强直、运动迟缓等。PD的发病与黑质多巴胺(dopamine, DA)能神经元损伤后,纹状体多巴胺及其代谢产物的含量降低等有关。进一步的研究表明PD的发病机制与脑线粒体复合物的酶活性降低和线粒体结构紊乱有关。目前临床上还没有治疗PD的理想方法,针灸治疗PD在临床上取得了明显的效果,逐渐被人们所认识和利用。但在探索针刺治疗PD的机理上还不够深入。因此,本实验在建立PD模型的基础上,拟对针刺督脉穴治疗PD的机理做进一步的研究,应用行为学、高效液相、免疫组化、生物化学、电镜等技术,观察针刺督脉穴减少多巴胺神经元丢失和损伤以及调节DA和DOPAC的作用,观察对线粒体呼吸链酶复合物的影响,从改善线粒体功能的角度探索针刺调督止颤治疗PD的机制,为针灸临床治疗PD提供实验依据。 本实验分为两个部分：(1)通过观察针刺督脉“大椎”、“百会”穴对PD小鼠的行为学、黑质多巴胺能神经元、纹状体DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC)的影响,研究针刺督脉穴对PD多巴胺神经元的保护作用；(2)观察针刺督脉“大椎”、“百会”穴对PD小鼠脑线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ活性的影响,探讨针刺督脉穴保护脑线粒体功能的机制。 动物模型的建立及分组：选用C57BL/6小鼠,用0.3%MPTP(生理盐水配制)腹腔注射,连续5天,建立PD动物模型。动物随机分为5组：正常组、模型组、针刺组、美多巴组、针刺结合美多巴组(简称针美组)动物的存活期分别是14d、28d和56d。 主要实验结果如下： 1、针刺“大椎”、“百会”穴对PD小鼠行为学的影响 腹腔注射MPTP后,小鼠出现不同程度的活动障碍。造模14d,模型组小鼠的平均爬竿时间明显延长(p＜0.05),与模型组相比,针刺、针美组小鼠爬杆时间均有所减少(p＜0.05),而美多巴组小鼠爬杆时间比模型组无明显缩短；28d,三个治疗组小鼠的爬杆时间均较模型组缩短,其中针美组小鼠爬杆所用时间最短；56天,各组小鼠的平均爬杆时间无统计学差异。 2、针刺“大椎”、“百会”穴对PD小鼠黑质TH阳性神经元数目的影响 14d,模型组小鼠黑质TH阳性神经元数目较模型组明显减少,三个治疗组神经元数目多于模型组；28d,模型组28天小鼠神经元数目较正常组明显减少(P＜0.05),三个治疗组也较正常组减少(P＜0.05),针美组神经元数目较美多巴组明显增多(P＜0.05)；56d,模型组神经元数目明显少于正常组(P＜0.05),针刺组和针美组明显多于模型组(P＜0.05)。 3、针刺“大椎”、“百会”穴对PD小鼠脑DA及其代谢产物含量的影响 14d,模型组小鼠前脑内DA和DOPAC含量明显低于正常组(p＜0.05)；三个治疗组比模型组略高,但无统计学意义；28d,模型组小鼠前脑内DA含量明显低于正常组(p＜0.05),三个治疗组与模型组无明显差别,针刺加美多巴组前脑DOPAC的含量较模型组明显增多(P＜0.05)。 4、针刺“大椎”、“百会”穴对PD小鼠黑质神经元超微结构的影响 三个存活期中模型组可见黑质神经元核膜内陷,胞质内线粒体嵴紊乱或消失,溶酶体增多等变化；14d,三个治疗组中核膜内陷较模型组减轻；28d,针刺组和针美组只见少量线粒体嵴消失,核膜结构清晰,无明显内陷；56d,针刺组神经元有的线粒体嵴也消失,但轻于美多巴组,美多巴组神经元核膜结构基本正常也可见内陷,胞质内线粒体可见嵴消失,但数量较模型组少,针美组核膜结构清晰,无明显内陷,个别线粒体的嵴模糊或消失。 5、针刺“大椎”、“百会”穴对PD小鼠脑线粒体呼吸链复合物活性的影响 (1)对线粒体复合物Ⅰ的影响 模型组14d和56d时活性明显降低(P＜0.05)；美多巴组在14天和56天时活性也较正常组降低。而针刺组和针美组脑线粒体的活性无明显降低(p＜0.05)。 (2)对线粒体复合物Ⅱ的影响 模型组活性在56天明显降低(P＜0.05),针刺组在14天和56天可提高脑线粒体复合物Ⅱ的活性(P＜0.05),其他两个治疗组与正常组和模型组比无明显差异(P＞0.05)。 (3)对线粒体复合物Ⅲ的影响 14d、28d,各组之间无明显差异；56天,与正常组比较,模型组活性显著下降(p＜0.05),与模型组相比,针刺组和针美组可抑制复合物Ⅲ的下降(p＜0.05)。而美多巴组较针刺组明显降低(p＜0.05)。 (4)对线粒体复合物Ⅳ的影响14d,各组之间无明显差异；28d,模型组活性明显降低(P＜0.05),针刺组、针美组较模型组活性升高(P＜0.05)；56天,模型组活性明显降低(P＜0.05),美多巴组、针美组活性较模型组升高(P＜0.05)。 结论：以上结果提示针刺或针刺合并美多巴治疗在一定程度上达到调督止颤、增效减毒的作用,其机制可能与减轻黑质多巴胺神经元的损伤、减少神经元的丢失、改善多巴胺的代谢以及线粒体酶的活性有关。这为丰富针灸调督止颤的科学内涵,为临床应用针灸治疗帕金森病的增效减毒作用提供现代科学基础。