营养相关基因(fdr3和TaNRT1)功能的进一步研究

【摘要】： Ⅰ 玉米缺铁相关基因fdr3的western与Southern blotting fdr3是由缺铁诱导的玉米根cDNA文库经差示筛选得到的阳性克隆之一。用 IPTG诱导含有fdr3重组质粒的E.coli菌株，其表达产物经SDS-PAGE分离后 与铁相关抗血清进行western blotting，结果有一杂交区带。缺铁胁迫处理的玉米 根可溶性蛋白经与同一抗血清进行western blotting，在40kD左右出现一杂交区 带。对fdr3进行DNA序列分析，发现其中有一个1068bp的开放读框（ORF）， 这可能与western blotting检验的40kD蛋白区带在分子量上具有相关性。在 GenBank中的同源性分析表明它是一未知基因。其编码氨基酸序列的疏水性分析 表明其中含有几个疏水结构域，表现出完整功能蛋白的结构特点。从fdr3的 1068bp的ORF中切下约800bp的片段，作为探针，分别与玉米、小麦、烟草和 衣藻的基因组DNA进行Southern blotting，结果在玉米、小麦和衣藻中都有明显 的杂交信号，而在烟草中未出现信号，推测此片段可能不是双子叶植物烟草基因 组DNA的成分。 Ⅱ 小麦NO_3~--transporter基因片段的克隆与pGEX-2T-TaNRT1融合蛋白基因的 构建 在前人实验的基础上，为了进一步研究小麦的高亲和力NO_3-transporter基因 TaNRT1（AF fragment），把从小麦根总RNA中，通过RT-PCR获得的高亲和力 NO_3-transporter基因片段与pBluescript-T质粒载体连接重组。经过克隆筛选、酶 切和测序分析，表明所构建筛选的重组体正确，其外源片段为657bp左右，并修 正了前期PCR产物的AF片段的多处N碱基。接着，又从T-vector上切下构建 到系列表达载体pGEX-1，2T，3X上，经酶切及测序分析（只有pGEX-2T-TaNRT1 测序了）表明构建的重组体结构正确。用IPTG对系列表达重组体（三个）进行 诱导表达，经电泳分析，其中pGEX2-2T-TaNRT1表达产物分子量偏小，未发现 预期的52kD左右的融合蛋白区带，现正进一步调整诱导条件，以期得到表达正 确的融合蛋白。