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野生二粒麦(T.dicoccoides)谷蛋白亚基双向电泳分析及其LMW-GS 编码基因的分子克隆

肖英华  
【摘要】:小麦贮藏蛋白中的高、低分子量谷蛋白亚基是决定小麦面粉品质优劣的重要因素。野生二粒小麦(Triticum dicoccoides,AABB,2n=4x=28)是普通小麦基因组AABB的供体,具有较高的蛋白含量和丰富的遗传变异,是小麦品质改良的重要基因资源,因此对其谷蛋白亚基进行鉴定及其编码基因的分子克隆对于定向改良小麦品质以及了解贮藏蛋白基因家族结构、分子进化关系具有重要的意义。本研究利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-D PAGE:A-PAGE×SDS-PAGE)三种电泳方法对28份野生二粒小麦的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)进行分离鉴定,然后采用等位基因特异PCR(Allele SpecificPCR,AS-PCR)方法对低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因进行分子克隆、序列测定和比较分析。主要研究结果如下: ●高、低分子量谷蛋白亚基的凝胶电泳分离与鉴定 利用SDS-PAGE方法,对28份野生二粒小麦高分子量谷蛋白亚基进行初步分离鉴定,结果发现:Glu-A1位点编码Null、1、1~*、2~*四种类型的亚基;Glu-B1位点编码12种亚基组合类型,分别是6+8,7+8,13+19,6+16,6+19,6~*+8,6.1+22.1,13+22.1,13+22~*,14+15,13+Null,Null+16,其中除了前三种外均为新鉴定的亚基类型。在此基础上采用SDS-PAGE,A-PAGE和A-PAGE×SDS-PAGE三种不同的方法对9个具有新型HMW-GS的材料进行进一步分离鉴定,结果发现:部分HMW-GS在SDS-PAGE和A-PAGE中的迁移率存在差异。除了Y22的亚基1~*分成两个点以外,其余在SDS-PAGE中鉴定的HMW-GS在A-PAGE×SDS-PAGE中均为清晰单一的蛋白质点,由各自特定的基因编码。 利用SDS-PAGE和A-PAGE×SDS-PAGE两种不同方法,对野生二粒小麦LMW-GS进行了鉴定。根据1996年Jackson等提出的LMW-GS等位基因命名方法,对4个野生二粒小麦LMW-GS等位基因进行了鉴定,结果如下:Y6(g,f),Y7(d,f),Y22(g,f),Y25(d,f)。此外,以LMW-2型标准品种Simeto(Null,7+8)作对照,对28份野生二粒小麦进行筛选,结果发现11份具有LMW-2型电泳图谱,表明它们可能象硬粒小麦一样具有较好的加工品质,因此野生二粒小麦可能具有丰富的优质谷蛋白亚基基因资源。 ●LMW-GS基因的分子克隆、序列比较与分子进化分析 利用一对特异的LMW-GS基因引物X13306-F595和X13306-R2103进行AS-PCR扩增,从三个野生二粒小麦中均获得约1600bp的单一特异强扩增条带,分别回收克隆后进行DNA序列测定,得到基因全长分别为1649bp、1472bp、1754bp 首都师范大学硕士学位论文 的包括上下游和编码区的LMW-GS完整基因序列。根据N一端氨基酸序列,发现这 三个基因编码的成熟蛋白的第一个氨基酸是异亮氨酸,因此它们编码的蛋白是 LMW-i型亚基。与11个已知LM私GS基因进行序列比较,克隆的三个基因具有 LMW-GS典型的结构特点,编码区依次由信号肤、区域n、区域111、区域W和 区域V组成,缺失了区域I。在这三个基因中,LMW-GS特有的8个半肤氨酸残 基全部位于C一端区域,与LMW-m和LMW-s型亚基存在较大差异。分子进化树 分析表明:LMW-i型与LMW-m型和LMW-s型基因各自形成两个独立的分支, LMW-m型和LMW-s型基因在一个分支内也形成两个亚组,但具有较高的同源性。 可以推测不同LMW-GS类型的基因经遗传分化后沿着各自不同的方向进化,随着 DNA重复、缺失、插入、突变等事件发生,LMW-i型基因比LMW-m型和LMW-s 型基因积累了更多的变异,从而形成一组具有独特特征的基因类型。对上述基因 的转化表达以及对面包品质的影响正在进一步研究之中。


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