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水稻缺铁上调基因中与膜泡运输相关基因Sec27p、ARHI的克隆、亚细胞定位与功能分析

闫莉婕  
【摘要】:水稻作为重要的粮食作物,其对铁相对低效吸收将会导致粮食作物缺铁,因此而导致的与缺铁有关的疾病成为威胁着人类健康的棘手问题之一。随着水稻基因组计划的完成,用功能基因组学来研究水稻缺铁相关基因的表达调控成为解决该问题的有效方法。 本论文针对我实验室前期的基因芯片的研究结果,对水稻缺铁胁迫下相对表达量最高——与膜泡运输相关的一组基因进行了分析。 通过水稻根尖细胞超薄切片的透射电镜观察,发现细胞质膜附近有突起的小泡,且缺铁(-Fe)处理水稻根尖细胞的小泡比加铁(+Fe)处理的小泡大,内含物更多,同时-Fe处理水稻根尖细胞的小泡呈现向胞内、胞外两个方向发生,+Fe处理的样品仅见向胞外发生的小泡。 对水稻缺铁胁迫下上调表达基因中与膜泡运输等相关的16个基因进行比对、分析。通过RT-PCR及REAL-TIME PCR的方法,对其中的ARHI、Sec27p、Tuftelin-interacting、pV72四个基因缺铁胁迫下上调表达进行了进一步的鉴定。 获得Sec27p、ARHI两个基因的全长cDNA;分别构建植物表达载体pCAMBIA1302-Sec27p、pCAMBIA1302-ARHI,通过侵染洋葱表皮细胞观察Sec27p-GFP、ARHI-GFP融合蛋白的瞬时表达,对目的基因进行了亚细胞定位,结果表明Sec27p蛋白定位于细胞质中靠近细胞质膜附近的小泡上;ARHI蛋白位于细胞核及核周边膜状结构上。通过叶盘法转化获得Sec27p、ARHI的转基因烟草,结合NCBI序列比对及蛋白质分析软件的结果,对Sec27p、ARHI进行了功能预测。初步认为Sec27p可能为一内质网到高尔基体转运小泡衣被蛋白的亚基,为水稻在适应缺铁胁迫下根部细胞内膜泡运输增强提供了证据;ARHI可能是一种新的小G蛋白,与核孔对蛋白和RNA的运输等有关,从而调控相关基因的表达。


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