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野大麦盐诱导基因的筛选与克隆

王雪青  
【摘要】:土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要因子。培育耐盐农作物新品种是解决农作物盐胁迫的根本有效途径,而发掘、研究植物耐盐基因资源是培育耐盐新品种的重要途径。研究盐生植物的耐盐特性,并筛选和克隆盐诱导基因,将为植物耐盐基因表达机理的研究、以及进一步培育高耐盐力作物新品种奠定基础。 野大麦(Hordeum brevisubularum(Trin.)Link)是禾本科小麦族中耐盐性最强的盐生植物之一,在长期进化中形成了一套特殊的适应机制,具有重要的研究和应用价值。 为了充分了解野大麦的耐盐特性及挖掘、利用其重要耐盐基因,本研究以野大麦为材料分析了在盐胁迫下的耐盐生理响应,并应用cDNA-AFLP技术筛选和克隆了野大麦盐诱导基因(片段),取得结果如下: 1、野大麦在盐胁迫下的耐盐生理响应研究。比较了野大麦和典型甜土植物-小麦在NaCl胁迫下幼苗叶片质膜透性、含水量、地上和根部离子含量、脯氨酸含量、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性的生理响应,明确了野大麦的耐盐范围,探讨了野大麦可能的耐盐生理机制。结果显示,随盐胁迫浓度增加,野大麦的细胞膜透性、Na~+含量、脯氨酸含量、Na~+/K~+比、PEPCase活性增加,而含水量、K~+含量下降;其中脯氨酸含量增加幅度小于小麦,说明在盐胁迫下野大麦不是通过脯氨酸的积累来达到体内渗透平衡的;而野大麦PEPCase活性增加明显高于小麦,说明提高光合效率可能是野大麦实现盐适应的主要措施之一。 2、利用RNA指纹技术cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymophism)分析了野大麦在盐胁迫和非盐胁迫下根部基因表达的差异。采用256对引物筛选出40个差异表达的cDNA片段,通过Reverse Northern Blotting进一步鉴定出10个阳性差异表达cDNA片段,通过Blast分析,有8个TDFs与已知基因有一定的同源性,其中TDF1916与一系列蛋白激酶有较高的同源性。利用SMART RACE技术得到该基因cDNA全长,为1564bp,编码405个氨基酸。通过蛋白序列比对分析结果表明,该基因推导的氨基酸序列与CIPK蛋白激酶的两个功能域(催化域和调节域)有很高的同源性,因此推测该基因属于CIPK家族的新成员,命名为HbCIPK。通过RT-PCR分析,初步表明该基因受盐诱导表达。


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