模拟微重力下植物细胞生理及细胞电融合研究

【摘要】： 细胞电融合技术是一门实用性很强的生物技术，也是空间发展的生物技术之一。上世纪70年代以来，利用电融合技术产生体细胞杂种植株已有不少报道，但由于杂种细胞融合率较低，使得这项技术在生产上的应用潜力难以发挥，而空间微重力环境没有重力沉降和热对流等因素影响，使得杂种细胞融合率及活力率均有所提高，然而空间搭载成本较高，受到飞行时间和仪器重量的限制，试验不能多次重复，因此常采用模拟回转器旋转进行模拟失重的生物研究。目前微重力模拟试验主要集中于动物细胞、藻类细胞及对植物整个植株和种子的研究上，直接对植物细胞回转的研究较少。本试验采用旋转培养装置(RCCS)模拟微重力条件，对去除细胞壁的植物原生质体进行模拟微重力回转，观察模拟失重对原生质体状态、细胞层面上各种生理生化指标及自体电融合的影响，为微重力条件下植物细胞电融合机理提供理论参考。 本论文主要分为三个部分： 一、采用曼陀罗(Datura metel L．)茎段为外植体，在附加不同植物激素组合的培养基中对愈伤组织的诱导和植株再生进行研究。结果表明：采用修改的MS培养基(除去甘氨酸，维生素B1含量增加至0.5mg／L，pH5.5)附加2mg／L 2，4-D可由曼陀罗茎段诱导大量胚性愈伤组织；愈伤组织继代选用0.5mg／L2，4-D为宜；不定芽的诱导采用MS培养基(20g蔗糖，8g琼脂，0.1g水解干酪素)+6-BA(0.5mg／L)；幼苗进一步转接至1／2 MS+IBA(0.2mg／L)生根培养基中，可完成曼陀罗茎段愈伤组织诱导和再生植株的组织培养过程。 二、分别以烟草无菌苗(Nicotiana tabacum cv．Wisconsin 38)叶片，烟草悬浮系(T-BY-2)，曼陀罗愈伤组织为材料分离制备原生质体，并采用不同染料对原生质体活力和细胞核进行染色效果比较。结果表明：由烟草悬浮系得到的原生质体数量多、活力旺盛、耐受力好，更适合于模拟微重力试验；原生质体活力观察宜采用荧光素双醋酸酯(FDA)染色法，染色效果清晰，四嘧唑蓝(MTT)法则可定量反映原生质体活力；相对于其他细胞核染料，DAPI对不同来源的原生质体细胞核染色效果均较好，能够清晰地对原生质体进行观察和计数。 三、选用烟草悬浮系(T-BY-2)原生质体为材料对模拟失重下烟草原生质体生理及自体电融合变化进行探讨。结果表明：烟草悬浮系原生质体模拟失重以15rpm的回转速度较为适宜，回转后大部分烟草悬浮系原生质体形态未发生变化，少部分原生质体细胞质和液泡发生分离；与正常地面对照组相比原生质体活力有所下降；模拟失重下原生质体可再生细胞壁，与地面对照无明显差异；模拟回转初期烟草原生质体辅酶Ⅰ(NADH)含量高于地面对照组，随着时间延长NADH含量逐渐降低，均低于地面对照组，表明模拟微重力条件下烟草原生质体所需能量减少；另外模拟回转初期烟草原生质体微丝骨架解聚，F-actin含量低于地面对照，随着时间延长回转组微丝骨架含量逐渐恢复，与对照组F-actin含量相当，回转24h后原生质体F-actin含量反高于地面对照，具体原因还需进一步探讨；最后本试验对模拟失重处理后的原生质体进行电融合研究，结果显示双核细胞电融合率和融合时间没有发生明显变化，而融合原生质体活力率下降，并未达到预期空间电融合的效果。