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多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的构建、鉴定和筛选

徐粤宇  
【摘要】: 多枝赖草(Leymus multicaulis)(2n=4x=28=14Ⅱ,XmNs)是禾本科小麦族大麦亚族赖草属小粒种子类型的一个种,是我国新疆重要天然牧草,它分布于盐渍化荒漠草甸,目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。这些特性都是目前种植的大多数农作物、牧草与草坪草栽培品种,本身缺乏急需改良的特性。出于主要在我国分布,国外对其利用的研究较少。因此,分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因是非常必要的。 植物可转化人工染色体(TAC)载体结合了PAC载体和双元载体的优点,含P1质粒和Ri质粒的复制子,能在大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以单拷贝形式复制,一旦筛选到目标阳性克隆,不需要做繁琐并有可能导致目标基因丢失的亚克隆工作,不需要重新构建转化载体,可直接利用农杆菌转化系统将其转到植物体中进行基因功能互补实验,从而加速目的基因的实用化进程。 为了克隆和转化多枝赖草的优异抗逆性基因,以多枝赖草叶为材料提取细胞核,经钢丝细胞筛过滤,多次回收滤渣和离心上清中的细胞核,相差显微镜调浓度达10~8个/mL后,经LMP包埋,蛋白酶K降解核蛋白,脉冲电泳纯化回收后,在LMP凝胶中纯化2Mb以上DNA,经HindⅢ部分酶切再用脉冲电泳回收不同大小范围的DNA,电洗脱浓缩除盐,与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B,在卡那霉素和蔗糖选择压下筛选阳性克隆。用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H分别构建了文库Ⅰ和Ⅱ,约16.5和23.6万个克隆,插入片段长度为9kb~300kb,估计覆盖3~5倍多枝赖草基因组大小。文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中,每孔1.2mL菌液中平均约含500个克隆;同时从文库Ⅰ和Ⅱ分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中。 为了后续文库鉴定,将12块深孔96孔板中的40多万个混合克隆转存到3块384孔板中,连同14块单克隆384孔板都用GeneTAC~(TM) G3复制了2份,点高密度杂交膜6张。以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5′RACE-GR和3′RACE-GR为探针初步筛选到19个阳性克隆;同时还以6个多枝赖草抗逆相关EST序列,在GenBank、EMBL和DDBJ三大核酸数据库中进行比对延伸,均得到了相应电子克隆序列,各设计3对引物,准备用PCR-Pool法对文库Ⅰ和Ⅱ进行全面的筛选。为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。


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