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小麦及其近缘种α-醇溶蛋白的鉴定与编码基因的分子克隆

王聪艳  
【摘要】: 醇溶蛋白作为小麦胚乳中重要的贮藏蛋白,其组成和含量对小麦面粉的烘烤品质具有重要影响。普通小麦(Triticum aestivum L.,2n=6x=42,AABBDD)中的优质品种是研究小麦醇溶蛋白与优良品质关系的重要材料。粗山羊草(Aegilops tauschii,2n=2x=14,DD)是小麦D基因组的供体,具有丰富的贮藏蛋白等位变异,是小麦品质改良的重要基因资源。本研究以普通小麦优质品种和粗山羊草为材料,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对α-醇溶蛋白进行分离和鉴定,并利用PCR方法对其编码基因进行分子克隆,进而分析这些α-醇溶蛋白基因的分子结构特点及醇溶蛋白基因家族的同源性,同时对部分α-醇溶蛋白编码基因进行原核表达研究。主要研究结果如下: 1.粗山羊草和普通小麦α-醇溶蛋白的分离与鉴定 利用RP-HPLC对粗山羊草T15、T43、T26和普通小麦优质品种中优9507、藁城8901的α-醇溶蛋白组分进行初步的分离鉴定。通过MALDI-TOF-MS对鉴定结果进行进一步的验证,并获得各组分的精确分子量。结果发现,在粗山羊草中α-醇溶蛋白组分较少,T15中约为4个、T43中约为3个、T26中约为6个;而普通小麦中α-醇溶蛋白组分较为复杂,而且其分子量很接近,中优9507和藁城8901中α-醇溶蛋白组分都在20个左右,表明六倍体普通小麦α-醇溶蛋白的多态性较高。 2.α-醇溶蛋白编码基因的分子克隆与序列比较分析 利用一对特异的α-醇溶蛋白基因引物,以粗山羊草T15、T43、T26的基因组DNA和普通小麦中优9507、藁城8901的cDNA为模板分别进行AS-PCR扩增,均获得了约850bp左右的单一条带,分别回收并克隆到pGEM-T Easy载体上,DNA测序后得到19个α-醇溶蛋白基因,其中T15和T43各1个、T26 2个、中优9507 8个、藁城8901 7个。这些基因命名后已登陆GenBank,编号为EF561270-EF561288。 基因序列分析表明,所得序列均为以ATG起始密码子开始、以TGA密码子结束的完整的α-醇溶蛋白编码基因,推导的氨基酸序列具有典型的α-醇溶蛋白的序列结构特征,由20个氨基酸的信号肽、N端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ六部分组成,且部分基因推导出的分子量与质谱精确测定的分子量很接近,我们可以初步认为这些基因是质谱鉴定的蛋白的编码基因。氨基酸序列比对分析显示:这些基因与已知α-醇溶蛋白基因有很高的一致性,但也具有独有的特征。在Gli-At3和Gli-Z7的特征区Ⅱ前端发现了一个额外的半胱氨酸。半胱氨酸的增加有助于二硫键的形成,从而对面团特性产生影响。根据推导氨基酸序列所具有的四种T细胞抗原表位、多聚谷氨酰胺重复区的平均长度及同源性分析,我们对普通小麦中得到的基因进行了初步的染色体定位,将Gli-G2和Gli-Z3定位于6A染色体上;Gli-G1、Gli-G6、Gli-Z2、Gli-Z4和Gli-Z8定位于6B染色体上;Gli-G3、Gli-G4、Gli-G5、Gli-G7、Gli-Z1、Gli-Z5、Gli-Z7定位于6D染色体上。 3.克隆基因的原核表达 设计不扩增信号肽的表达引物,分别扩增T15、T43、T26、中优9507和藁城8901中的一个基因,扩增片断克隆到表达载体pGEX-4T-2上,转化到E.coli表达菌株BL-21(DE3)plysS。IPTG诱导后,收集菌液提取蛋白,进行SDS-PAGE分析,结果表明以上5个α-醇溶蛋白编码基因均在E.coli中获得了高效表达,表明我们克隆的这些基因在功能启动子的作用下具有表达活性。 本研究克隆的α-醇溶蛋白新基因以及在E.coli中的成功表达,为进一步研究它们的结构与功能奠定了基础,并有可能成为小麦品质改良的候选基因资源。


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