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重要致病菌表面抗原的分子生物学研究

胡波  
【摘要】:细菌表面抗原,如O-抗原、H抗原和K抗原等,细菌的重要组成部分。O-抗原位于细菌表面,是位于革兰氏阴性菌表面的脂多糖的重要组成部分,由多个寡糖单位组成,由于长期受到来自宿主的选择压力,具有非常丰富的多样性。大肠杆菌有180多种O-抗原,志贺氏菌有33种O-抗原,沙门氏菌有46种不同的O-抗原。O抗原的多样性主要是由于O抗原基因簇的遗传学多样性造成的。O抗原基因簇中的基因可以被分为3类:单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。本文重点研究了O-抗原合成相关的糖基转移酶的功能。糖基转移酶负责催化将糖加到其它糖、脂、蛋白、核酸等分子上,在所有生物体中行使着重要的生物功能。绝大多数的糖基转移酶家族的成员仅仅分为两个糖基转移酶超家族,命名为GT-A和GT-B超家族。按立体化学反应结合序列特征和糖基供体受体结构分类,糖基转移酶共分为90多个家族和一个未分类族。 本研究破译了9种沙门氏菌和4种大肠杆菌的O抗原基因簇,沙门氏菌和大肠杆菌被认为是在1.4亿年前从同一祖先分化而来。之前进行的许多研究一直认为,在沙门氏菌和大肠杆菌之间只具有三对相同的O抗原,本研究新发现在沙门氏菌和大肠杆菌之间存在4对相同或者相似结构的O抗原基因簇,高于以前人们的预期,表明沙门氏菌和大肠杆菌的O抗原具有更为紧密的关系。进化分析表明沙门氏菌和大肠杆菌之间共有的O抗原基因簇起源于同一个祖先,但基因簇内基因的分化速度要高于持家基因的分化速度,表明O抗原基因簇内的基因为了适应新的环境而受到的选择压力要高于持家基因。此外发现在这些基因簇分化的过程之中,糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因所受到的选择压力要明显大于单糖合成酶基因。 本研究对大肠杆菌O56和O152的葡萄糖糖基转移酶以及鲍氏志贺氏菌14型的O-抗原合成相关的半乳糖糖基转移酶进行了深入研究。包括酶反应动力学,酶的性质(离子,离子去污剂,pH值)对酶活性的影响,以及酶的底物特异性的研究。研究发现这三个酶的性质都比较接近,2价锰离子和镁离子都能较好的促进酶活,酶在较为宽泛的pH值范围都有活性,发现都对受体底物结构中的焦磷酸基团有要求,与酶的特异性识别底物有关,并通过点突变的方法鉴定了B14中与底物作用的重要氨基酸。 鞭毛是负责细菌运动的器官,鞭毛抗原,又名H抗原,是大肠杆菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一。细菌可选择性表达2个不同的鞭毛蛋白基因,称之为H-抗原的相位变异。相位变异细菌的一种重要机制,可以使细菌适应不至一种生存环境,尤其是可以逃避宿主免疫系统。传统观点认为大肠杆菌是单相的,但在一些菌株中也发现存在相位变异现象。研究已经表明,在所有的53种E. coli H抗原类型中,有44种的H抗原是由fliC基因编码的,剩余9种类型的H抗原基因均不位于fliC位点。本实验室之前的研究发现,在大肠杆菌H3和H47中,鞭毛蛋白基因操纵子所在的flk区域是一个典型的基因组岛flk GI,H抗原的相位变异是由flk GI的删除造成的。这是首次对大肠杆菌H-抗原相位变异的机制做出阐明。目前,只有编码大肠杆菌H17型鞭毛蛋白的基因以及其相位变异机制尚未破译。本研究在对大肠杆菌H17标准菌株全基因组的破译的基础之上,对大肠杆菌H17的鞭毛抗原基因进行了定位及功能鉴定。对大肠杆菌H17相位变异的分子机制做了深入研究,确定其相位变异的发生机制为一个基因组岛元件(编码H17抗原的基因在该基因组岛中)的丢失导致的相位变异。并且发现该基因组岛两端发生非同源重组,以环化的形式脱离细菌染色体。同时鉴定了介导该基因组岛非同源重组的整合酶的功能。


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