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芽孢杆菌胞外蛋白酶合成及抑菌功能的调控机制研究

高卫华  
【摘要】:芽孢杆菌作为人们最为熟悉的原核细菌之一,由于在发酵工业以及农业上的广泛应用而倍受关注,对于其代谢产物调控机制的研究一直是应用微生物学领域的热点之一。本研究以实验室保存的两株野生芽孢杆菌菌株作为出发菌株,利用Mini-Tn10进行了突变库的构建与功能基因的筛选,得到了一些与野生型菌株代谢产物差异显著的突变株。通过对突变基因的鉴定,分析了影响表型变化的机制,为芽孢杆菌的基因工程改造提供了借鉴。概括而言,本文的主要研究结果如下: 1.利用Mini-Tn10转座载体pIC333,对枯草芽孢杆菌菌株NK1010以及解淀粉芽孢杆菌菌株NK10.BAhjaWT进行了突变库的构建。质粒pIC333的自然转化效率为8.7×102(转化子/μg质粒)。检测表明,Mini-Tn10的突变效率可达0.49%。经37℃温度诱导4小时,质粒pIC333的丢失效率为97%。 2.以蛋白水解能力作为表型,从枯草芽孢杆菌NK1010的突变库中筛选得到一株蛋白水解能力增强的菌株GWH1023 (citB-),其蛋白水解能力约为野生型菌株的三倍以上。通过citB基因的互补表达,突变株的蛋白水解能力可以恢复到较低的水平。结合突变株的其他表型,如集群运动能力和生物被膜形成能力,显示此菌株的表型差异可能是由于调控因子DegU表达水平的增加引起的。另外,还考察了顺乌头酸酶C-端氨基酸Arg741和Gln745对该酶活力的影响情况,结果表明,通过将这两个氨基酸突变为Glu, citB基因的表达水平以及顺乌头酸酶的蛋白水平都有相应的增加,突变株的顺乌头酸酶酶活可增加四倍以上,而菌株的蛋白水解能力则明显低于野生型菌株NK1010及突变株GWH1023 (citB-)。 3.分别以抑细菌能力和抑真菌能力为表型,从解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT突变库中筛选得到表型变化的菌株若干。其中抑细菌能力增强的突变株3株,分别为L1 (secE), L3 (yukB)和L4 (purL);抑细菌能力减弱菌株—L8 (wapA)和L10 (ywqC)以及抑真菌能力减弱的菌株G3 (citB)和G7 (mycB)。 4.对突变菌株L4 (purL)的抑菌表型进行分析,purL基因的插入突变能够专一性的引起芽孢杆菌对革兰氏阳性细菌(藤黄微球菌)抑菌能力的增强,而对于真菌(黑曲霉)和阴性细菌(大肠杆菌)的抑菌能力没有变化。进一步分析表明,焦磷酸硫胺素合成路径的阻断是引起突变株L4 (purL)抑菌能力增强的原因。通过在培养基中添加焦磷酸硫胺素,突变株L4 (purL)的抑菌能力可以恢复到正常水平。 5.利用酸沉淀和反相HPLC纯化,对突变株L4 (purL)与野生型菌株NK10.BAhjaWT的脂肽类代谢产物进行了比较分析,确认突变株与野生型菌株具有相同的脂肽类代谢产物组成。对HPLC的不同分离组分分别进行了活力检测与MALDI-TOF质谱检测,结果表明抑菌活力较高的组分是由几种不同物质组成的混合物,其抑菌能力可能是来自于几种物质的协同作用。


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