PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究

【摘要】：第一部分：PTHrP和BMP-6在乳腺癌中的表达机制研究 乳腺癌是一种常发性恶性肿瘤,是导致全世界女性死亡的主要因素。研究表明,在世界范围内,每年约有50万人死于乳腺癌。 乳腺癌的一个突出的生物学特征是易发生转移。乳腺癌在发生初期,往往表现出过度增殖和凋亡减少,导致肿瘤细胞快速增殖。在晚期阶段,乳腺癌的转移成为导致病人死亡的一个重要因素,最常见的转移器官为骨,死于乳腺癌的患者中有80%都发生了骨转移。 乳腺癌的发生和转移是一个多因素参与并通过多步骤完成的复杂过程。涉及正常乳腺上皮细胞转变成为多潜能分化的间充质细胞,并失控增殖生成原位癌；原位癌细胞的脱离和外侵；乳腺癌细胞的定向转移；乳腺癌细胞在靶器官的黏附和增殖。但其生物学过程和分子机制尚未明确,这严重影响了乳腺癌的治疗。 PTHrP是从高钙血症相关的恶性肿瘤组织中分离出的一种蛋白质分子,由于其基因序列和结构与甲状旁腺激素(PTH)相类似而得名。PTHrP常常在骨转移肿瘤中检测到,PTHrP的过表达与肿瘤骨转移和预后有关。 骨形态发生蛋白-6(Bone morphogenetic protein-6, BMP-6)是转化生长因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员,其作用方式主要是通过与细胞膜上的BMP I型和Ⅱ型受体结合,并依靠Smad通路传递信号来调节细胞的生长和分化。除了在诱导成骨方面发挥重要作用外,BMP-6还是调控骨生长和器官发育的重要功能因子。近年来越来越多的研究表明BMP-6的异常表达与肿瘤的发生和转移密切相关。在乳腺癌细胞系和乳腺癌患者肿瘤标本中均发现BMP-6基因的异常表达。 本研究通过定量PCR检测了35个乳腺癌标本中的PTHrP和BMP-6 mRNA的表达水平,结果发现在17个高表达PTHrP的标本中有12个低表达BMP-6,在18个低表达PTHrP的标本中有17个高表达BMP-6,表明PTHrP和BMP-6 mRNA的表达呈现负相关,这就提示我们PTHrP和BMP-6之间可能存在负调控关系。 为阐明PTHrP抑制乳腺癌中BMP-6基因表达的分子机制,本文构建了人全长PTHrP cDNA表达载体,用不同浓度的PTHrP质粒转染MCF-7细胞,通过半定量和定量PCR检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达,通过Western-blot检测发现PTHrP可剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的蛋白水平。用定量PCR检测发现外源转染的PTHrP可时间依赖性地抑制MCF-7中BMP-6 mRNA的表达。鉴于PTHrP在生物体内以多种多肽形式存在,为了进一步探讨PTHrP抑制BMP-6基因表达的分子机制,我们用氨基端多肽PTHrP (1-40)和羧基端多肽PTHrP (107-139)处理MCF-7细胞,结果发现仅PTHrP (1-40)剂量依赖性地抑制MCF-7中BMP-6的mRNA和蛋白表达水平,而PTHrP (107-139)没有任何作用。 接着,我们构建了长度为1.2kb的BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶表达质粒,通过荧光素酶活性分析该启动子对PTHrP(1-40)或PTHrP (107-139)刺激的应答活性,发现在剂量为10nM的PTHrP (1-40)的刺激下,BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性下调40%,剂量为100nM时活性下调73%,而PTHrP(107-139)对BMP-6基因启动子驱动的荧光素酶活性没有作用。 为了研究PTHrP (1-40)调控BMP-6基因表达的信号途径,我们采用了PKA、PKC、p38MAPK和MEK途径抑制剂,结果发现仅PKA信号途径抑制剂可以消除PTHrP (1-40)对BMP-6基因表达的抑制作用,此外发现PKA信号途径激活剂发挥与PTHrP (1-40)相似的抑制BMP-6基因启动子活性效果。 此外,我们通过BMP-6基因沉默和过表达证实,PTHrP (1-40)通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌的增殖和细胞周期进程。 综上所述,本部分实验证实PTHrP是BMP-6的上游分子,通过PKA信号途径抑制BMP-6基因的表达,进而通过下调BMP-6基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。 第二部分：人骨形态发生蛋白6在毕赤酵母中的分泌表达 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来快速发展起来的一种真核表达体系,和其它表达系统相比,有着无法比拟的优势,它既操作简单,易于扩大培养,适于工业化生产,又具有真核细胞翻译后修饰加工的特点。毕赤酵母表达系统已被越来越广泛地应用于外源重组蛋白的表达,到2005年为止,超过500种外源重组蛋白已经在毕赤酵母表达系统中成功表达。 骨形态发生蛋白属于转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)超基因家族,是一种多功能的细胞调节因子,它不仅能够促进新骨的形成,还在细胞生长、分化、迁移、凋亡以及胚胎和器官发生中发挥重要作用。人骨形态发生蛋白6(BMP-6)参与调控机体泌尿和神经等系统的发育,影响细胞的增殖和凋亡,是细胞正常生长和发育的重要调节因子。BMP-6在体内先以前体蛋白(包括信号肽、前肽和成熟肽)合成,然后再经过翻译后修饰加工形成同源或异源二聚体来发挥其生物学功能。 目前国内外重组骨形态发生蛋白的生产多见于真核哺乳动物和昆虫细胞,虽然活性较高,但是产量少而且成本高。而原核表达系统虽也能表达出有活性的骨形态发生蛋白,但由于缺乏蛋白质翻译后修饰加工机制,通常活性较低。本实验旨在利用毕赤酵母表达系统分泌表达hBMP-6蛋白。 本实验首先以重组质粒pcDNA6A-BMP-6为模板通过PCR扩增hBMP-6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达载体pPIC9K中。重组质粒pPIC9K-hBMP-6经Sac I酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115, PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果表明获得的hBMP-6成熟肽以分子量约为34 kD和18kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性。