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他莫昔芬抑制巨噬细胞FABP4表达—糖皮质激素受体和过氧化物酶体增殖物激活受体γ依赖型机制

姜玫秀  
【摘要】:心血管疾病已经成为人类健康与生命的重大威胁。冠心病是心血管疾病中最常见的一种,而动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)则是造成冠心病的主要病理之一。动脉粥样硬化的发生与多种因素有关,如血管内皮损伤,单核细胞和巨噬细胞聚集,血管平滑肌细胞增生以及多种趋化因子和细胞因子的产生等。其中,单核细胞衍生的巨噬细胞转化成泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的起始与关键步骤。 脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding proteins, FABPs)是一组同源小分子细胞胞浆蛋白,分子量为14-15kD,能够结合疏水性脂类并对其进行细胞内亚组织转运。脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein, FABP4,又称为A-FABP或aP2)是细胞内FABP家族成员之一。FABP4广泛存在于各种正常组织、细胞中,但在脂肪组织和巨噬细胞中高表达。FABP4能够可逆性结合饱和及不饱和长链脂肪酸,促进脂肪酸代谢和转运。此外,FABP4在其他生物学过程中尤其是代谢综合征的许多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪饮食诱导的动脉粥样硬化发展,在巨噬细胞中诱导FABP4高表达会促进泡沫细胞形成,表明FABP4在动脉粥样硬化的发展中也具有重要作用。 他莫昔芬(tamoxifen)是一种选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator, SERM),同时也是抗血管再生因子和蛋白激酶C的抑制剂。在体内细胞色素P4502D6(CYP2D6)的作用下,tamoxifen可以被羟基化为四羟他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen或4-OH-tamoxifen),四羟他莫昔芬具有更强的SERM活性。过去20多年中,作为化疗药tamoxifen在临床上用于治疗早期和晚期高表达雌激素受体的乳腺癌,同时大量的临床前和临床试验证明tamoxifen具有心血管保护功能。例如,tamoxifen可以降低绝经后妇女心肌梗死的发生率以及降低颈总动脉的内膜厚度;还可以增加男性晚期动脉粥样硬化内皮依赖性血流调控的血管扩张;在动物模型中,tamoxifen可以降低雄性野生型小鼠和apoE-/-小鼠以及通过手术绝经的雌猴体内由高脂肪饮食诱导的动脉损伤与动脉粥样硬化的发生。Tamoxifen虽具有心血管保护功能,但其作用的具体分子机制尚未完全清楚。因此本论文研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen能否通过抑制FABP4表达以达到减少泡沫细胞形成从而抑制动脉粥样硬化发展的目的,同时我们将深入研究tamoxifen作用于FABP4表达的具体分子机制。 首先,我们分离来自于雌性和雄性野生型小鼠腹腔的原代巨噬细胞,在tamoxifen和4-OH-tamoxifen作用下,发现tamoxifen和4-OH-tamoxifen抑制小鼠原代巨噬细胞FABP4蛋白表达且不存在性别依赖现象。我们前期研究成果表明地塞米松(dexamethasone, Dex)、匹伐他汀(pitavastatin)与dexamethasone结合、激活过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPARy)等皆诱导FABP4表达,为此,我们研究tamoxifen和4-OH-tamoxifen对上述诱导作用的拮抗效果。通过Western blot检测我们证明了tamoxifen和4-OH-tamoxifen能有效的拮抗上述诱导作用。在转录水平上,我们通过Northern blot发现tamoxifen和4-OH-tamoxifen抑制巨噬细胞FABP4mRNA表达,进一步我们对FABP4启动子活性进行分析,探究tamoxifen和4-OH-tamoxifen下调FABP4表达的具体分子机制。通过分析,我们发现FABP4启动子区域存在糖皮质激素受体(GR)的正负调节元件(pGRE和nGRE)以及PPARγ的两个潜在结合元件(PPRE1和PPRE2)。双荧光素酶活性实验和EMSA实验结果证明,tamoxifen和4-OH-tamoxifen通过激活nGRE活性并增加核转录因子GR与nGRE结合同时抑制PPRE1活性以及核转录因子PPARγ与PPRE结合,从而下调FABP4启动子活性,抑制FABP4转录与表达。之后,我们利用Western blot结合荧光标记定位实验证明,tamoxifen和4-OH-tamoxifen不影响GR表达,但是可以抑制由dexamethasone诱导的GR核转移。 此外,我们检测tamoxifen和4-OH-tamoxifen对FABP4表达的抑制作用在小鼠体内和人血单核细胞衍生的巨噬细胞中是否存在。我们分别喂食雌性和雄性apoE-/-小鼠含有tamoxifen的高脂食物(0.5%的胆固醇和21%的脂肪)一个月,之后分别收集小鼠腹腔巨噬细胞和脂肪组织,检测FABP4蛋白表达的变化情况。结果与体外实验一致,tamoxifen以非性别依赖的方式抑制巨噬细胞和脂肪组织中FABP4蛋白表达。同时,我们从志愿者身上获取血液并提取白细胞,其衍生的巨噬细胞中FABP4蛋白表达同样被tamoxifen和4-OH-tamoxifen所抑制,与小鼠体内外实验结果一致。 为研究tamoxifen是否可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成,我们喂食雌性apoE-/.小鼠含有tamoxifen的高脂食物(雄性小鼠已有报道)16周后,完整分离出其主动脉进行油红O染色后观察斑块的形成情况,发现tamoxifen确实可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成。此外,我们通过FABP4RNA干扰实验证明tamoxifen减少泡沫细胞形成并起到抑制动脉粥样硬化作用是与其抑制FABP4表达密切相关。 综上所述,本文首次证明了tamoxifen和4-OH-tamoxifen通过GR和PPARy两条信号通路相结合来抑制巨噬细胞FABP4表达从而减少FABP4诱导的泡沫细胞形成,最终起到心血管保护作用。我们的研究为临床上治疗动脉粥样硬化等疾病提供了一定的理论基础。


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