收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

铜绿假单胞菌生物被膜形成早期相关基因的研究

单志英  
【摘要】:铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌,它能在机体腔道、各种组织及体内留置的生物医学材料的表面形成生物被膜,从而导致顽固性感染。据文献报导,鞭毛介导的泳动和Ⅳ型菌毛介导的蹭动在被膜形成的早期起重要作用,这两种运动能力丧失的突变子,不能在塑料表面形成生物被膜。本文以一株临床分离的铜绿假单胞菌PA68做受体菌,应用Mu转座复合物技术从反向遗传学的角度对鞭毛和Ⅳ型菌毛运动的相关基因进行研究。 Mu转座复合物技术近两年刚兴起,尚未见应用到假单胞菌属的报导,本文先以质粒pSMC28代替Mu转座复合物对PA68的电转化条件进行优化。详细研究了细菌生长状态、感受态细胞的浓度和贮备方式,以及电脉冲场强等参数对转化效率的影响,结果表明:在细胞生长至对数期(OD_(540)=0.7-0.8)时收集菌体,在低温条件下,制备成浓度为10~(11)cells/ml的感受态细胞,设置高脉冲场强(13kV/cm)电击,能获得1.68×10~8CFU/μg DNA的最高转化效率。选用生长时期和电击电压两个主要参数验证Mu转座复合物对PA68的电转化条件,结果表明Mu转座复合物与质粒的最佳电转化条件相一致。用筛选出的优化条件成功地将Mu转座复合物转入到PA68中,得到3.66×10~4CFU/μg DNA的高转化效率,建立了菌株PA68的Mu转座突变文库。 对Mu转座突变子进行泳动和蹭动能力的检测,从约2000个突变子中,筛选出泳动能力缺陷型突变子4株,蹭动能力丧失或减弱的突变子11株。Sournthern杂交证实转座子均为单拷贝插入。将转座子及其侧翼的基因组序列克隆到pUC18载体上,以转座子末端的反向序列做引物,对其侧翼的基因组序列进行核苷酸测序,并将测序结果在GenBank中进行BLAST比对,从而确定转座子插入到基因组中的位置。结果显示,4个泳动缺陷型突变子中,转座子分别插入到uvrD、phzF1、zwf和PA0171 4个基因中;11个蹭动缺陷型突变子中,转座子分别插入到8个不同基因的内部:有三个分别插入到PA0413基因的前端,中部和后端;有两个分别插入到pilQ的不同位置;其它突变子中,转座子分别插入到pilV、algR、PA1821、PA1822、PA4959和PA0171中。上述11个基因中,有6个基因属于Ⅰ类或Ⅱ类基因,它们的功能已在铜绿假单胞菌或其它菌株 南开大学博士研究生毕业(学位)论文 中得到实验证实;PAO4!3和PAj82]属于m类基因,其功能是根据它们所编码 蛋白质的保守氨基酸基序或其基因序列与己知功能基因的相似性推测得出的,但 缺乏实验证据;PA4好夕,PAI822和PA口171则属于W类基因,但最新的一篇 研究报道证明PA刃卯为一信号蛋白,参与铜绿假单胞菌的蹭动,PA0171和 PA了822的功能则完全未知。 对基因PA口了71和PA了822进行了核普酸序列测定。序列比对发现PA了822 的编码产物与一种信号传导蛋白PilL有一定的同源性,PA口了71则与任何功能已 知或未知的基因都没有高同源性。利用反向互补实验进一步研究基因PA017]和 PA1822的功能,结果表明,携带PA0171基因的质粒pDN18S使突变子 PA68PA 0171::Mu的蹭动和泳动能力均恢复至正常水平;而携带PA j822基因的 质粒pDN 18F则使突变子PA68PA了822::Mu的蹭动能力得以部分恢复。根据同 源重组原理,用插入失活的基因置换出染色体上的正常基因,在铜绿假单胞菌标 准株PAOI中分别构建了基因PA017)和PAI822失活的突变子。运动能力检测显 示,突变子PAO IPA口了71::Gmr丧失了泳动和蹭动能力;而突变子PAO IPA1822:: Gmr则没有蹭动能力。上述实验结果证明PA017]基因参与了p aeruginosa的泳 动和蹭动,PAI822基因则为蹭动所必需。 在电子显微镜下观察PA017I突变子和PAI822突变子的细菌形态,结果表 明,PA0j7)突变子有正常的鞭毛,但IV型菌毛缺失;别1822突变子的鞭毛和 IV型菌毛均完好存在,推测PAOI7)可能为一调节基因,控制鞭毛和IV型菌毛 的运动,同时控制IV型菌毛的生物合成。而PA了822可能是一个信号蛋白,能 够感受外界环境信号的刺激从而调节IV型菌毛的运动。 本文首次将Mu转座复合物技术应用到假单胞菌的功能基因组的研究中,为 假单胞菌属的研究提供了一个新的遗传学手段。并首次证明PA1822和PAOI7! 基因与P. areuginosa的运动有关,为透彻理解生物被膜的形成机制提供了实验 依据。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 金正江,彭少华,李从荣;铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与耐药的关系研究[J];中华医院感染学杂志;2004年08期
2 饶宪,唐英春,张扣兴,张天托;抗生素对铜绿假单胞菌产生藻酸盐的影响[J];中国抗生素杂志;1997年04期
3 张克斌,金晓琳,朱军民,胡晓梅,饶贤才,胡福泉;铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组测序[J];第三军医大学学报;2002年04期
4 谭艳,方治平,宋晓红,张海军,沈月华;铜绿假单胞菌parC基因突变与耐氟喹诺酮的关系[J];微生物学杂志;2003年06期
5 凌立君,张伟云,肖杭,刘瑞,杨金宇,侯亚义;铜绿假单胞菌外毒素的制备及其抗肿瘤作用[J];中国生化药物杂志;2004年05期
6 许宏涛,陈东科,俞云松,张秀珍;多重耐药铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶耐药机制研究[J];中华医院感染学杂志;2005年01期
7 廖立新,曹郁生,李国辉,陈燕;铜绿假单胞菌外膜蛋白疫苗的制备[J];中华烧伤杂志;2005年03期
8 佟训靓;李明成;;铜绿假单胞菌多重耐药性分子机制的研究[J];北华大学学报(自然科学版);2006年01期
9 丁友法;王伟;毛剑锋;;浙江丽水铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶编码基因研究[J];中国抗生素杂志;2006年12期
10 赵书平;姜梅杰;张晖;;耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制及1型整合酶基因的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2007年09期
11 卢焱,叶萍,王靖,张永生,凌代文;铜绿假单胞菌全细胞脂肪酸气相色谱分析及应用[J];中华医院感染学杂志;1997年01期
12 黄怡,刘瑞,王靖,刘忠令;小鼠铜绿假单胞菌肺感染中胸腺细胞凋亡的研究[J];中华医院感染学杂志;1998年03期
13 李玲,熊盛道,徐永健,张珍祥;铜绿假单胞菌外膜蛋白D_2与耐药性的关系研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年03期
14 文怡;顾兵;刘根焰;黄珮珺;赵旺胜;;南京地区铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因分子类型分析[J];江苏医药;2007年02期
15 陈敏;徐莉萍;杨静;;铜绿假单胞菌耐药性研究[J];检验医学与临床;2007年04期
16 程曦;杜宝中;范红;陶传敏;刘梅;张磊;谢轶;贾文祥;;产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子的研究[J];南方医科大学学报;2007年06期
17 陈登宇;夏佩莹;孟庆荣;;铜绿假单胞菌L型的诱导及其产绿脓菌素能力的研究[J];实用医药杂志;2008年01期
18 张煜星;武寒雪;祝建波;刘焕;周鹏;;铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达[J];安徽农业科学;2008年35期
19 王春新;赵琪;周丽珍;糜祖煌;陈国千;;中国部分地区铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因型研究[J];中华医院感染学杂志;2010年05期
20 王贵年;吴娟;;黄芩苷对铜绿假单胞菌生物膜的影响[J];中国病原生物学杂志;2010年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周天恩;何志捷;邓义军;黄子通;蒋龙元;;ICU铜绿假单胞菌感染的药物敏感监测[A];中华医学会急诊医学分会第十次全国复苏中毒学术论文交流会论文汇编[C];2004年
2 陈亚红;姚婉贞;刘振英;张晓伟;;2000至2005年耐亚胺培南铜绿假单胞菌的变迁及耐药性[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年
3 张丽霞;张立;杜佰风;冯爽;;162株铜绿假单胞菌的耐药性分析[A];中华医学会第11届全国内科学术会议论文汇编[C];2007年
4 唐爱琴;王小娜;范玲玲;;86株铜绿假单胞菌耐药性分析[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
5 沈继录;朱德妹;;耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌多药外排泵机制研究[A];中华医学会第八次全国检验医学学术会议暨中华医学会检验分会成立30周年庆典大会资料汇编[C];2009年
6 何晓锋;曹晋桂;张虎;马文杰;吴镝;焦力群;王敏;方鉴;;铜绿假单胞菌的耐药性变化及其DNA多态性分析[A];中国医院协会第十五届全国医院感染管理学术年会资料汇编[C];2008年
7 窦懿;;烧伤病房11年抗菌药物使用与铜绿假单胞菌耐药率变化[A];全国烧伤早期处理专题研讨会论文集[C];2002年
8 殷少军;何礼贤;瞿介明;欧周罗;胡必杰;王葆青;陈雪华;;免疫受损宿主铜绿假单胞菌肺部感染时趋化因子基因表达研究[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
9 詹毅;余兰;;老年病科铜绿假单胞菌医院感染危险因素调查[A];生命科学与微生物专辑[C];2004年
10 倪明;田德英;宋佩辉;余冰;陈红云;李霞;;DNaseI对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响[A];中华医学会全国第九次感染病学学术会议论文汇编[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 单志英;铜绿假单胞菌生物被膜形成早期相关基因的研究[D];南开大学;2004年
2 陈林;铜绿假单胞菌内在耐药性相关基因的筛选及研究[D];西北大学;2010年
3 陈一强;绿原酸对铜绿假单胞菌生物膜抑制作用及其机制的体内外研究[D];广西医科大学;2010年
4 王杰;中国部分地区碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药机制及分子流行病学研究[D];浙江大学;2011年
5 俞莺;常压低温等离子体对小鼠伤口定植绿脓杆菌的作用研究[D];华中科技大学;2011年
6 陈媛媛;粘附分子MAdCAM-1/VCAM-1在奶牛乳腺炎作用中的初步研究[D];吉林大学;2012年
7 王平;铜绿假单胞菌临床分离株致病特征及Quorum Sensing系统调控机制研究[D];华中科技大学;2010年
8 魏殿军;临床分离菌株耐药性分析及铜绿假单胞菌耐药机制的探讨[D];天津医科大学;2004年
9 胡洪波;机械通气新生儿铜绿假单胞菌定植或/和感染的流行病学研究[D];华中科技大学;2010年
10 叶露;pvdQ基因在人肠道上皮细胞中的表达作用以及对铜绿假单胞菌致病性影响的研究[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 魏志华;多药耐药铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排系统的耐药作用及其调控基因mexR的突变情况[D];安徽医科大学;2010年
2 李良;铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与碳青霉烯类药物耐药的关系研究[D];山西医科大学;2011年
3 林丽华;大蒜素对铜绿假单胞菌生物被膜的干预作用及机制初步研究[D];重庆医科大学;2009年
4 段佳丽;铜绿假单胞菌中影响RsmA调节基因的筛选及调节途径研究[D];西北大学;2011年
5 汪浙炯;PhoQ/PhoP与外膜蛋白OprH在铜绿假单胞菌对氨基糖甙类抗生素耐药性中的相互关系和作用机制[D];浙江大学;2011年
6 曾祥萍;AL-1单用及联合用药对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其作用机理研究[D];暨南大学;2011年
7 郭生玉;铜绿假单胞菌生物被膜肺感染模型的建立及抗生素干预的研究[D];中国医科大学;2002年
8 吴雷;医院感染铜绿假单胞菌肺炎细菌耐药性及预后分析[D];南方医科大学;2010年
9 章喻军;铜绿假单胞菌外膜耐药和保护原功能蛋白组学的研究[D];厦门大学;2007年
10 麻琼丽;产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及产酶条件优化[D];海南大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王振岭;铜绿假单胞菌耐药问题严重[N];中国医药报;2002年
2 李曙平;铜绿假单胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中国中医药报;2003年
3 天津医科大学总医院检验科 胡志东;关注铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的耐药[N];健康报;2009年
4 胡德荣;哺乳动物转座因子系统创立[N];健康报;2005年
5 金雯珏 记者 王春;我首创哺乳动物转座因子系统[N];科技日报;2005年
6 实习生 金雯珏 本报记者 王春;“夸娥”因子:快速识别基因身份[N];科技日报;2005年
7 林红燕 叶晓光;医院革兰阴性杆菌耐药变化规律研究[N];中国中医药报;2003年
8 白毅;复旦大学世界首创哺乳动物转座因子系统[N];中国医药报;2005年
9 驻沪记者 张莉;先声药业重拳出击高端抗生素[N];医药经济报;2008年
10 北京朝阳医院 张洪玉教授;生物被膜病在作怪[N];健康报;2000年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978