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葡萄糖转化异丁醇代谢途径的设计与表达

谢厦  
【摘要】:能源问题和环境问题日益严峻,使得人们越来越关注生物质能源的研究。与传统生物质能源——乙醇相比,高碳醇,特别是支链高碳醇,具有较小的挥发性和腐蚀性,较高的辛烷值和能量密度。2008年,James C Liao课题组在大肠杆菌中利用非发酵途径方法合成了异丁醇,经对异丁醇代谢途径及发酵工艺不断优化后,得率达到了理论值的86%。然而,发酵结束后仍有一部分的葡萄糖没有被利用,表明高浓度的异丁醇产物抑制了大肠杆菌的代谢。研究表明,枯草芽孢杆菌对异丁醇的耐受性高于大肠杆菌,并且自身具有异丁醇合成途径的优势基因,因此,本研究选择在枯草芽孢杆菌中利用合成生物学的思想构建异丁醇的代谢通路,以缬氨酸生物合成途径中的α-酮异戊酸盐为前体物,展开合成异丁醇的相关研究。 本实验以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭质粒pHP13为基础,连接了枯草芽孢杆菌中的强启动子p43,构建了表达载体pP。从乳酸乳球菌基因组DNA上克隆下脱羧酶编码基因kivd,从酿酒酵母基因组DNA上克隆下脱氢酶基因ADH2,依次连接在表达载体pP上,由p43启动子启动两个基因的表达,构建了重组载体pPKA。采用Spizizen转化法将重组载体pPKA转入B. subtilis 168中,获得了重组菌B. subtilis 168/pPKA。经气质联用鉴定,重组菌的发酵液中有异丁醇存在,说明两个外源基因在重组菌中成功表达,催化α-酮异戊酸盐生成了异丁醇。在成功获得异丁醇生产菌株B. subtilis 168/pPKA后,对其培养条件进行了优化,优化内容包括培养基中葡萄糖的加入量和缬氨酸的加入量,发酵时间,接种量,装液量,初始pH等。优化结果为发酵培养基中葡萄糖的加入量为3%,缬氨酸的加入量为2%,接种量为1%,装液量为50ml/250ml,初始pH为7,发酵时间为35h。最终异丁醇的产量为0.607g/l。


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