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几株基因工程链霉菌的构建

梁玲玲  
【摘要】:链霉菌是重要的抗生素生产菌,其代谢过程的深入研究可以从基因水平解释体内代谢物变化,以及对目标代谢产物的影响,从而为工业生产菌株的分子水平优化提供方向。 乙酸是链霉菌无氧代谢的末端产物,乙酸累积抑制菌体生长和外源蛋白的表达。乙酰-CoA是某些次级代谢产物的重要前体,在理论上阻断乙酰-CoA生成乙酸的途径有可能促进菌体生长,同时增加目标产物的产量。敲除糖酵解途径中的关键限速酶磷酸果糖激酶主要合成基因来使碳代谢流从糖酵解途径转移到磷酸戊糖途径,可研究两条代谢途径对葡萄糖代谢的影响,以及不同代谢途径的中间产物对次级代谢物质合成的作用,对初级代谢的进一步研究有指导意义。透明颤菌血红蛋白所具备的捕捉和释放氧气的能力使之在宿主细胞发酵时可以更好地满足宿主细胞氧气的需求。在链霉菌中表达透明颤菌血红蛋白,能够改善链霉菌对高氧的需要,促进体内代谢,在理论上可能提高发酵过程中目的产物的产量。 本文利用RED敲除原理分两步敲除链霉菌乙酸代谢途径关键酶pta-ackA基因和磷酸果糖激酶基因pfkA1。通过同源对比,扩增出关键酶基因。通过PCR、酶切、连接将其克隆到cosmid载体上,构建中间质粒。将质粒转化到大肠杆菌BW25113/pIJ790体内,然后将安普抗性标记片断目标基因置换,构建出敲除载体。通过原生质体转化方式,导入利迪链霉菌。并通过松弛培养,筛选得到链霉菌pta-ackA缺失菌株AS01和pfkA1缺失菌株AS02。 根据透明颤菌血红蛋白基因vgb碱基序列和链霉菌基因密码子偏好性设计PCR引物,对vgb基因的部分密码子加以突变。然后将vgb基因克隆到pIB139质粒强启动子的下游,构建出整合载体pIB139-vgb。通过原生质体转化的方式将整合载体转入链霉菌,通过抗性筛选获得链霉菌vgb表达菌株AS 03。 基因工程链霉菌的构建为研究基因功能,以及链霉菌体内代谢网络的变化奠定了很重要的基础。


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