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新型交联酶聚体技术及其在蛋白组学与生物催化中的应用

王梦凡  
【摘要】:本文针对交联酶聚体(Cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)在制备及应用上的两类缺陷,即制备过程中沉淀步骤酶活损失大,催化大分子底物反应时传质限制严重,分别提出了糖类添加剂改善CLEAs酶活及多孔化CLEAs改性两种制备新方法,并将其应用于分析化学与生物催化领域的三个体系,即蛋白组学分析中的胰蛋白酶酶解过程、青霉素酰化酶酶法合成阿莫西林、木瓜蛋白酶酶法降解壳聚糖制活性低聚糖,具体结果如下: 1.采用90%浓度乙醇为沉淀剂,0.075%戊二醛为交联剂,以传统方法制备得到了酶活收率为44%的胰蛋白酶CLEAs;胰蛋白酶CLEAs的最适催化温度(70oC)、最适催化pH(9.0)、热稳定性和储存稳定性,均较游离酶有所提高;CLEAs“脚手架”状微观形貌决定了其优良的稳定性和高催化活性。 2.将胰蛋白酶CLEAs用于蛋白组学的酶解肽谱分析中,有效防止了高酶浓度下胰蛋白酶的自水解;同时结合高温辅助酶解、超声辅助酶解可实现高通量肽谱解析,分别缩短酶解时间至60min和60s,显著提高了分析通量和序列覆盖度。 3.针对传统青霉素酰化酶CLEAs制备过程中沉淀步骤酶活损失大的缺陷,设计了在有机沉淀步骤加入糖类添加剂以提高最终CLEAs酶活的新技术,得到酶活收率为79.3%的青霉素酰化酶CLEAs,比传统制备工艺酶活提高30%;揭示了糖类添加剂(如海藻糖)以“水替代”方式与酶蛋白结合,起到维持酶蛋白天然结构,保持CLEAs活性的作用机理。 4.将糖类添加剂改善的青霉素酰化酶CLEAs应用于抗生素阿莫西林的酶法合成反应中,考察了CLEAs对阿莫西林合成收率和选择性的影响;引入30%甲醇介质体系并在高底物比条件下反应,阿莫西林收率可达57%。 5.针对传统方式制备的木瓜蛋白酶CLEAs在催化大分子底物反应时效率低的问题,提出以淀粉为致孔剂,在CLEAs内部形成孔隙结构,制成多孔化CLEAs(p-CLEAs)的改进技术;将p-CLEAs应用于大分子蛋白底物牛血清白蛋白和乳清蛋白时,酶解效率分别提高了95.9%和90.4%;证明了p-CLEAs优良的催化效果源于其多孔化的内部结构和更大的催化比表面积。 6.将多孔化木瓜蛋白酶CLEAs应用于酶法降解大分子底物壳聚糖制备生物活性低聚糖反应,相同条件下还原糖释放量为游离酶催化时的85%,是传统CLEAs的4倍;采用超滤膜分离技术得到了质量分数为67.5%、相对分子量为5~10kD的具有优良抗菌性能的低聚壳聚糖产品。


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