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耐盐月季的选育及表达拟南芥AtDREB2A-CA对月季耐盐性的研究

TCHOUOPOU LONTCHI Josine(思妮)  
【摘要】:月季(Rosa chinensis Jacq.),是中国最主要的花卉之一,已在中国栽培了上千年,于1793年传入西欧。它是一种城市花卉,主要种植于北京等其他37个城市。同时,月季花种植受土壤盐碱条件的影响,这是对其生长和产量最有害的因素之一。盐胁迫在世界范围内制约着农作物的生长和产量,已成为中国灌溉地区主要和日趋严重的问题之一,影响着7%的土地面积和5%的耕地。虽然植物盐胁迫调控的研究已经取得了成果,但月季仍然没有取得进展。改进作物的耐盐性仍需要获得新的方法(无论是通过自然繁育还是转基因手段)和鉴定耐盐性的高效技术。 本研究为了提高月季的耐盐性,我们首先在NaCl压力培养基上通过组织培养再生技术进行自然繁殖。其次,脱水应答元件结合因子(DREB)主要与植物对非生物压力如寒冷、干旱和高盐的反应有关。此外,月季花大部分DREB基因的功能和调控这些反应的潜在机制依然需要进一步研究。所以,我们先以拟南芥作为模式植物对AtDREB2A-CA基因(拟南芥转录因子DREB2A脱水应答顺式作用元件相互作用序列)进行了功能分析。最后,在月季花中表达了AtDREB2A-CA基因。 在适宜的压力选择培养基上胚胎发育之后,对NaCl压力的缓解使小植株有了更好的适应性和易恢复性。与盐胁迫植株(SSIV)(434.75±0.44ug/g)相比,盐胁迫恢复植株(RIV)中脯氨酸含量(371.42±0.88ug/g)减少,但此值仍然显著高于对照组(368.79±0.58 ug/g)。盐胁迫恢复植株含水量(69.24±0.65%)也显著高于对照组(54.67±1.31%)。经过温室栽培再转移至试验田中的选育植株在生理和超微结构上表现出对NaCl压力的适应性。 表达AtDREB2A-CA基因的转基因拟南芥增加了水、脯氨酸、N、P和K含量,通过激活它们的合成提供应答和阻止植物免受NaCl伤害。而且,AtDREB2A-CA基因降低了叶绿素和总类胡萝卜素含量,这并没有影响盐胁迫条件下24小时之后的植物生长。本研究所观察到的转基因植株叶片上表皮的形态学改变仅发生在胁迫的初始阶段,并且栅栏薄壁组织体积的增加诱导了对NaCl胁迫的抗性。AtDREB2A-CA基因诱导了转基因植株无NaCl时类囊体膨胀和NaCl胁迫下轻微的类囊体聚积。同时,也发现对了淀粉粒合成的抑制作用。在NaCl压力条件下,当质体小球持续增加时白色体增加并最终保持恒定。这表明,NaCl胁迫能引起野生型植株叶绿体的损伤。有趣的是,AtDREB2A-CA基因表达引起的(这些)变化引起了植物叶片内膜对NaCl胁迫的耐受性。此外,一定浓度的H2O2(特别是0.3, 1.2 and 1.5 mMol/l)能够激活种子萌发和根的伸长,而LiCl只能激活种子萌发。 本研究提出了一种由农杆菌介导的侵染月季芽点的新方法。利用半芽点作为外植体进行转基因是其中最有效的方法,最佳条件为侵染时间6min,AS浓度100μM。转AtDREB2A-CA基因月季植株积累了较高的含水量(91.56±3.15%),脯氨酸含量(555.11±7.8μg/g),以及N(2.93±0.09%)、P (2.59±0.26%)、K (1.44±0.21%)含量,较低的叶绿素a、b(0.50±0.01 (X=m/M)和总类胡萝卜素(0.21±0.01 (X=m/M)含量,这些在野生型(植株)中的含量分别为78.87±1.25%; 350.76±13.93μg/g; 0.83±0.01%; 0.633±0.03%; 1.11±0.14%; 0.88±0.09 (X=m/M); 0.50±0.05 (X=m/M)。拟南芥研究结果表明,这种生理活性可用来参照其对NaCl的耐受力。蛋白质印迹分析表明AtDREB2A-CA介导了Cu/Zn-SOD蛋白的活性,并且高浓度NaCl条件下(200和300mM),Cu/Zn-SOD蛋白调节机制受AtDREB2A-CA激活。叶片上表皮超微结构分析表明,在野生型植株中叶片分泌细胞膨胀更为明显,转基因植株细胞间隙变小。我们还发现除了只有当NaCl浓度达200mM的时候,外褶皱的合成会受抑制之外,AtDREB2A-CA基因的表达也抑制压力和非压力性转基因植株中叶片角质层的合成。在NaCl浓度为200和300 mM条件下,转基因植株叶绿体呈纺锤形,并且显示出类囊体排列成特定的基粒,褶皱和小型的淀粉粒清晰可见。 我们首先可以推断,转基因繁殖的小植株具有水分保持的能力。脯氨酸的合成和可用性可以解释它在新环境中的调节机制。生理和超微结构的适应性说明,可能在养分获取和利用过程中存在一种遗传变异性,在植物育种过程中,利用养分将是一种可行的技术手段。其次,在模式植物拟南芥中AtDREB2-CA激活与盐胁迫耐受性相关下游基因,表明在遗传改良培育压力耐受性植物中,它可能是一个良好的候选基因。本研究提出的一种新的农杆菌介导的月季侵染方法,可以用于盐压力环境中大规模快速繁殖盐胁迫耐受性植物。在月季中AtDREB2-CA基因的表达调节了植物在适应NaCl压力时的生理活性。此外,该基因与月季通过激活Zn/Cu-SOD蛋白表达的盐胁迫应答途径有关。表达该基因的月季植株所提供的叶片细胞超微结构的构造(淀粉粒的缺失或微小化和角质层的薄化)与NaCl压力耐受性植物的特征相似。最后,表达AtDREB2-CA基因并具有NaCl压力耐受性的月季植株已被移栽至温室中正常生长三个月。


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