利用代谢工程、辅酶工程及酶工程构建重组酿酒酵母木糖利用菌株以生产乙醇的研究

【摘要】：当今世界石油能源日渐枯竭,而人类对于能源的需求又与日俱增。在这种情况下,生物乙醇作为一种无污染的可再生能源,成为了极具前途的燃料替代品之一。然而,利用玉米、高粱等富含六碳糖的谷物进行发酵生产乙醇的传统方法,却存在着与人争粮的问题。同时,工业和农业残余物中存在大量富含木糖等五碳糖的木质纤维素,研究如何把这些五碳糖高效的转化为乙醇,对于解决能源以及环境问题都有着重要的意义。 本实验使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为模式生物进行了一些木糖代谢方面的研究。首先,本研究使用RT-PCR的方法对S. cerevisiae中一些组成型启动子在木糖培养基中的转录强度进行了测量,选出了其中最强的4个启动子pHXT7,pTPI1,pFBA1,pCCW12,并使用这4个强启动子在不同程度上过表达来自毕赤酵母P.stipitis的木糖还原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2以及S. cerevisiae内源的木酮糖激酶基因XKS1,构建出两株高通量的XR-XDH系统重组木糖代谢菌株KAM-3X(XYL1,XYL2,XKS1单启动子表达)和KAM-6X(XYL1,XYL2,XKS1双启动子表达),两株菌均能在72h左右完全发酵50g/l的木糖,乙醇产率分别为0.280g/g和0.310g/g;同时菌株KAM-6X可以在96h内消耗完100g/l的木糖,乙醇产率为0.34g/g,而KAM-3X在相同时间内只能消耗75g/l的木糖,乙醇产率为0.32g/g。这说明,随着XYL1,XYL2,XKS1转录强度的增加,可以增加重组菌株的木糖消耗能力,部分降低木糖醇产率并提高乙醇产率,但是单纯的增加转录强度并没有从根本上解决木糖醇积累的问题。因此,需要解决XR-XDH系统存在的辅酶不平衡问题,才能减少副产物木糖醇的积累从而进一步增加乙醇产率。 本研究对重组木糖发酵菌株KAM-6X进行混合糖发酵性能测试,结果显示绝大部分木糖的消耗总是在葡萄糖消耗完以后才开始,而且随着混合糖中葡萄糖浓度的升高,木糖消耗速率会越来越慢。经过后续实验的验证,证实这种抑制是由于葡萄糖发酵后产生的乙醇所致。 为了解决由于XR-XDH系统造成的辅酶不平衡问题,本研究首先尝试改变XR的辅酶偏好性。XR的2-2C12和K270R这两种突变型,是有文献报道的偏好NADH而不是NADPH的突变型,由于文献中未给出实际发酵数据,因此本研究在菌株KAM-6X中引入了这两种突变型并测量了实际发酵性能。结果显示,2-2C12突变型严重影响了XR酶活,使其基本无法转化木糖;而K270R突变型虽然部分影响了XR酶活以及其木糖转化速率,但是辅酶偏好性的转变却使KAM-6X(K270R)的木糖醇产率从KAM-6X的0.105g/g大幅降低到了0.026g/g,同时乙醇产率从0.297g/g提高到了0.312g/g。这证明了改变辅酶偏好性以降低副产物木糖醇的积累从而提高乙醇产率的可行性。此外,本研究直接针对辅酶系统本身进行改造,向重组木糖发酵菌株KAM-3X中引入了酿酒酵母内源的缺失了前导肽的NADH激酶POS5(-17)和来自乳酸乳球菌Lactococcus lactis的NADH氧化酶noxE,并测量了菌株的发酵性能。结果显示,POS5(-17)的引入使得重组菌株的木糖醇产率与对照相比从0.177g/g上升到了0.298g/g,同时乙醇产率从0.271g/g下降到了0.213g/g,与预想的结果相反。而noxE的引入则使得重组菌株的木糖醇产率从0.191g/g大幅下降到了0.058g/g,下降达到69.93%;同时乙醇产率从0.211g/g提高到了0.294g/g,增加了39.33%,达到了预期的设想。 本研究通过易错PCR的方法获得了来自Piromyces sp的木糖异构酶基因(XI)的两种突变型XImut5和XImut8,携带这两种突变型XI的菌株,利用木糖的速度与对照相比,获得了十分显著的提高。对照KAM-2XKS(XI)只能在木糖培养基中极其缓慢的生长,无法产生乙醇,而KAM-2XKS(XImut5)和KAM-2XKS(XImut8)则可以在120h左右基本耗尽20g/l的木糖,最终产生4-5g/l的乙醇。经过后续实验证实,这种酶活的提升是由于其mRNA稳定性得到了提升造成的。