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基于genome shuffling的高产nisin菌株的选育及性状分析

张彦飞  
【摘要】:Nisin是由乳酸乳球菌产生的具有抑菌作用的小分子多肽,因其能被人体内的蛋白酶水解不会对人体造成伤害,所以广泛地应用于肉类、乳类等食品的防腐。本论文以提高乳酸乳球菌YF11nisinZ的产量为目标,利用硫酸二乙酯化学诱变和对实验室保存的紫外诱变的菌株驯化培养构建genome shuffling的亲本菌株库,经过4轮genome shuffling,获得一株nisin高产菌株F44,对F44的发酵培养基以及发酵条件进行了优化;利用场发射扫描电镜进行了对F44与原始菌株YF11的细胞形态进行了观察;荧光定量PCR对F44与YF11中nisin合成相关基因表达进行分析。获得了如下主要研究结果: 以YF11作为原始菌株,利用硫酸二乙酯诱变获得三株nisin产量和耐受性以及葡萄糖耐受性都有所提高的菌株H1、H2、H3,通过驯化培养的实验室保存的紫外诱变的的菌株得到耐受性和产量都有所提高的菌株U1、U2、U3,此六株菌作为genome shuffling的出发菌株。 对此六株出发菌株U1、U2、U3、H1、H2和H3以原生质递归融合的方式进行四轮genome shuffling,以nisin耐受性和葡萄糖的耐受性作为筛选依据,获得了一株性状良好的菌株F44,它对nisin的耐受性为14000IU/mL,葡萄糖的耐受性为16%,nisin产量为2994IU/mL,为原始菌株YF11的2.92倍,是6个出发菌株中效价最高的菌株U2效价的2.12倍。 利用响应面法对F44发酵培养基以及发酵条件进行优化,发酵培养基初始pH7.15、半胱氨酸0.28g/L、蔗糖30.9g/L nisin效价为3400.24IU/mL,比优化前nisin的产量提高了17%。在最优条件下对F44进行发酵罐发酵补料,并且控制发酵液的pH,nisin产量最高可达4023IU/mL,比未补料时提高了18.3%。 电镜分析结果发现,高产菌株F44的体积要大于YF11,大约为YF11的1.217倍。对荧光定量PCR结果分析发现nisin的合成基因nisZ的表达量是原始菌株YF11的1.48倍,抗性相关基因nisI的表达量为原始菌株YF11的2.3倍,翻译后修饰基因nisB、C、T的表达量也都有不同程度的提高。nisFEG的表达量与YF11相比呈现降低的趋势。这些结果为我们进一步的了解nisin合成相关基因功能及提高nisin产量提供了重要的信息。


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