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枯草芽孢杆菌核黄素合成途径相关基因的修饰

夏苗苗  
【摘要】:在枯草芽孢杆菌的核黄素合成代谢途径中,核黄素操纵子(rib)表达水平与核黄素激酶/FAD合成酶(ribC)活性,是影响核黄素过量合成的关键因素。本文研究了rib操纵子表达元件的修饰和mRNA稳定子替换的效应,以及ribC基因点突变对核黄素过量合成的影响。 首先采用DNA片段和质粒原生质体转化方法,对B.subtilis24A1菌株的基因重组能力进行了检验,发现其在原生质体状态下没有同源重组能力,或者重组率低于4×10-3,不适合作为基因修饰的出发菌株。 以B.subtilisL30为出发菌,通过氯霉素抗性基因与rib操纵子启动子区的双交换重组,构建了核黄素缺陷株B.subtilisLX31,作为rib操纵子表达元件进一步修饰的出发菌。通过同源重组方式,分别构建了rib操纵子启动子-35区consensus化修饰,mRNA前导区被gsiBmRNA稳定子替换的重组菌株B.subtilisLX32;以及rib操纵子启动子-35区consensus化修饰,mRNA前导区被asnHmNRA稳定子替换的重组菌B.subtilisLX33。采用qRT-PCR方法检测重组菌胞内rib操纵子转录的mRNA水平,发现使用gsiBmRNA稳定子修饰的rib操纵子,其mRNA水平相对出发菌提高1531倍;使用asnHmNRA稳定子修饰的rib操纵子,其mRNA水平相对出发菌提高9倍。结果表明,rib操纵子启动子-35区consensus化修饰,以及采用gsiBmRNA稳定子替换mRNA前导区,能够使rib操纵子组成型高表达。 用带有B.subtilis24A1突变型ribC基因及红霉素抗性标记的重组质粒,转化菌株LX32,在抗性平板上筛选得到了黄色菌落LX34。经测序验证,发现LX34菌株ribC基因的启动子-35区第一个碱基发生了T→C点突变。摇管发酵显示,LX34菌株培养36h,核黄素产量达到2.13g/L,高于24A1菌株1.94g/L的产量,且菌株LX34的生长能力优于24A1。结果表明,ribC基因启动子-35区的T→C点突变,其遗传效应与编码序列的G596A突变相当,可以使核黄素过量合成。


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