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表达纤维素酶的酿酒酵母工程菌株构建及其利用木质纤维素发酵产醇研究

洪解放  
【摘要】:本研究在系统考察δ-整合方式、标记基因、倍性、交配型、重组/杂交等因素对单个纤维素酶基因表达或多个纤维素酶基因共表达影响的基础上,对所得工程菌株进行了以利用纤维素发酵产醇为主的综合评价,以探讨其作为CBP菌株的应用潜力。 单个纤维素酶基因的表达研究。1.构建了δ-整合平台,并进行了评价,结果表明筛选标记基因影响菌株的酶活。2.瑞氏木霉cbh1、cbh2和棘孢曲霉cbh1在酿酒酵母中成功得到表达,三个CBH酶组分之间存在协同作用。3.对表达BGL的菌株,其酶活、生长和发酵性能受菌株倍性、交配型和碳源影响。菌株BGL-aα具有最佳的发酵性能,在仅添加和氏璧纤维素酶(10FPU/g biomass)、尿素为氮源的情况下发酵7天最大乙醇浓度达到18.26±1.34g/L。4.考察了2N~4N菌株的孢子菌株在的应用潜力,结果表明3N菌株的孢子菌株具有最大的提高酶活的潜力,筛选得到了一个稳定的菌株A-8,其BGL活力比出发菌株提高了116.84%。以上结果说明交配型、倍性、和碳源等因素均影响菌株酶活及发酵产醇性能。 三类纤维素酶基因共表达研究。1.分步整合的策略构建得到菌株W1、W2合W3,共表达:分三步将T. reesei egl2、A. aculeatus bgl1和三种cb(h瑞氏木霉cbh1、cbh2和棘孢曲霉cbh1)依次δ-整合至W303-1A染色体上,构建得到表达一种、两种和三种纤维素酶的菌株W1、W2和W3,酶活分析和发酵产醇评价结果表明EG、BGL和CBH之间存在协同作用。在外加和氏璧纤维素酶(10FPU/g biomass)、发酵7天的情况下,菌株W3的最大乙醇浓度为28.20±0.84g/L,乙醇得率达到理论得率的59.82%±1.78%。2.鸡尾酒整合策略构建得到菌株LA1、LA2、LA3和LA4,对它们进行了酶活分析和发酵产醇评价,结果表明菌株LA3性能最优。3.以LA3为出发菌株构建得到1N~4N菌株,对它们进行了利用酸碱预处理玉米芯发酵产醇评价及酶活分析,结果表明交配型和倍性对菌株发酵产醇性能和纤维素酶活性的影响不明显,在外加和氏璧纤维素酶(10FPU/g biomass)的情况下,发酵性能最好的菌株为LA3、LD3aa和LT3aaα,发酵10天最大乙醇浓度(g/L)分别为35.18±1.56、34.51±1.41和36.75±1.78,乙醇得率分别达到理论得率的74.63%±3.31%、73.21%±2.99%和77.96%±3.78%。4.对菌株LA3和杂交菌株Maα-33的发酵条件进行了优化,结果表明:(1)最佳和氏璧纤维素酶用量均为10FPU/g biomass;(2)两菌株表达的BGL已能满足酶解需要,无需额外添加;(3)氮源明显影响菌株的发酵产醇性能,两菌株最适氮源分别为尿素和玉米浆;(4)适当提高酶解发酵温度可提高菌株的发酵产醇性能;接种量明显影响菌株乙醇发酵,最适的接种量为25%。 综上,多拷贝、高效表达bgl1的2N菌株BGL-aα,和协同共表达EG、BGL和CBH的1N菌株LA3,均具有一定的CBP菌株应用潜力。本研究对δ-整合方式及影响外源基因在δ-整合型菌株中表达的多个因素进行的系统考察,将有助于发展和丰富酿酒酵母的遗传操作技术手段。


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