载基因微球的制备及其在促进内皮细胞增殖方面的初步应用

【摘要】：本文制备了可降解载基因微球(Microparticles，MPs)，利用MPs/pEGFP-ZNF580复合物转染人脐静脉内皮细胞（HUVECs），达到了促进HUVECs增殖和迁移目的。针对高分子量聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)对细胞毒性高的问题，本文利用低分子量PEI制备了可降解型基因载体，并进行了评价。 1.为了克服高分子量PEI作为基因载体引起的细胞毒性问题，以聚乙二醇单甲醚(mPEG)、3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮(MMD)、乙交酯(GA)和低分子量PEI为原料，制备了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物(mPEG-b-P(MMD-co-GA)-g-PEI)，经自组装形成“核-壳”结构MPs。其中，MPs的疏水“核”由P(MMD-co-GA)组成，以它作为交联点，连接着众多的PEI和PEG链段，从而形成具有亲水性且带正电荷的“壳”。 MPs吸附并压缩ZNF580基因，形成MPs/pEGFP-ZNF580复合物。与高分子量PEI相比，MPs和MPs/pEGFP-ZNF580复合物的细胞毒性大大降低。MPs/pEGFP-ZNF580复合物的转染效果与LipofectamineTM2000的转染效果相似，经转染60小时后，HUVECs的增殖和迁移得到提高。本文提供了一种制备低毒性非病毒基因载体有效方法。 2.为了达到pEGFP-ZNF580从MPs/pEGFP-ZNF580复合物中持续释放的目的，合成了具有不同降解速率的三嵌段共聚物，进而制备了具备不同降解速率疏水核心的MPs。首先，合成了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-PMMD-g-PEI)、甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA)-g-PEI)和甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI)三嵌段共聚物。之后，经自组装形成了MPs。 pEGFP-ZNF580能够通过该复合物转染进入HUVECs，western blot分析表明ZNF580关键蛋白表达水平升高至35.74%-46.11%，pEGFP-ZNF580能够持续释放25天。这种MPs/pEGFP-ZNF580复合物在实现组织工程支架和人工血管的快速内皮化方面，具有潜在的应用价值。 3.为了实现MPs对HUVECs的选择性转染，通过接枝Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽，制备了靶向性三嵌段共聚物，即REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV)和REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯-共聚-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV)。以此为基材制备了HUVECs靶向性MPs。 在HUVECs和人脐动脉平滑肌(HUASMCs)的共培养体系中，MPs/pEGFP-ZNF580复合物能够特异性地选择转染HUVECs，促进内皮细胞增殖，并抑制HUASMCs增殖。结果表明，这种MPs/ZNF580复合物具有特异性内皮细胞选择功能。