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载基因微球的制备及其在促进内皮细胞增殖方面的初步应用

石长灿  
【摘要】:本文制备了可降解载基因微球(Microparticles,MPs),利用MPs/pEGFP-ZNF580复合物转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),达到了促进HUVECs增殖和迁移目的。针对高分子量聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)对细胞毒性高的问题,本文利用低分子量PEI制备了可降解型基因载体,并进行了评价。 1.为了克服高分子量PEI作为基因载体引起的细胞毒性问题,以聚乙二醇单甲醚(mPEG)、3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮(MMD)、乙交酯(GA)和低分子量PEI为原料,制备了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺三嵌段共聚物(mPEG-b-P(MMD-co-GA)-g-PEI),经自组装形成“核-壳”结构MPs。其中,MPs的疏水“核”由P(MMD-co-GA)组成,以它作为交联点,连接着众多的PEI和PEG链段,从而形成具有亲水性且带正电荷的“壳”。 MPs吸附并压缩ZNF580基因,形成MPs/pEGFP-ZNF580复合物。与高分子量PEI相比,MPs和MPs/pEGFP-ZNF580复合物的细胞毒性大大降低。MPs/pEGFP-ZNF580复合物的转染效果与LipofectamineTM2000的转染效果相似,经转染60小时后,HUVECs的增殖和迁移得到提高。本文提供了一种制备低毒性非病毒基因载体有效方法。 2.为了达到pEGFP-ZNF580从MPs/pEGFP-ZNF580复合物中持续释放的目的,合成了具有不同降解速率的三嵌段共聚物,进而制备了具备不同降解速率疏水核心的MPs。首先,合成了甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-PMMD-g-PEI)、甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA)-g-PEI)和甲氧基-聚乙二醇-嵌段-聚(3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮-共聚-丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺(mPEG-b-P(MMD-co-LA-co-GA)-g-PEI)三嵌段共聚物。之后,经自组装形成了MPs。 pEGFP-ZNF580能够通过该复合物转染进入HUVECs,western blot分析表明ZNF580关键蛋白表达水平升高至35.74%-46.11%,pEGFP-ZNF580能够持续释放25天。这种MPs/pEGFP-ZNF580复合物在实现组织工程支架和人工血管的快速内皮化方面,具有潜在的应用价值。 3.为了实现MPs对HUVECs的选择性转染,通过接枝Arg-Glu-Asp-Val(REDV)多肽,制备了靶向性三嵌段共聚物,即REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA)-g-PEI-g-REDV)和REDV-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-聚(丙交酯-共聚-乙交酯-共聚-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-接枝-聚乙烯亚胺-接枝-REDV (REDV-g-PEI-g-P(LA-co-GA-co-MMD)-g-PEI-g-REDV)。以此为基材制备了HUVECs靶向性MPs。 在HUVECs和人脐动脉平滑肌(HUASMCs)的共培养体系中,MPs/pEGFP-ZNF580复合物能够特异性地选择转染HUVECs,促进内皮细胞增殖,并抑制HUASMCs增殖。结果表明,这种MPs/ZNF580复合物具有特异性内皮细胞选择功能。


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