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截短型PF4慢病毒载体的构建及抗血管新生活性研究

王听月  
【摘要】:血管新生对于实体瘤的生长与转移是一个关键步骤,抑制肿瘤血管的生成可以达到抑制肿瘤生长的目的,因此以肿瘤血管新生为靶点的治疗策略逐渐发展成为肿瘤治疗领域的研究重点。血小板因子4(platelet factor-4,PF4)是一种内源性抗血管生成因子,它通过多种机制抑制内皮细胞的迁移和增殖,以此抑制血管生成。慢病毒载体作为一种常用且研究较多的基因转移系统,以其能转染较难转染的细胞、组织,将治疗基因安全有效的整合到靶细胞基因组中,目的基因表达稳定持久、转移基因容量较大等优势,在基因治疗中扮演重要角色。随着研究的深入,慢病毒载体在肿瘤基因治疗方面也取得了很大进展。本课题构建了携带截短型血小板因子4片段——PF447-70-RGD的慢病毒表达载体,将其包装为活性病毒,并以其介导的PF447-70-RGD为研究对象,探讨其体外抑制血管新生的生物学活性,为抗血管生成基因疗法治疗肿瘤奠定了基础。本研究首先将血小板因子4片段PF447-70-RGD,从保存的载体pcDNA3.1(+)-PF447-70-RGD上扩增出来,然后将其插入慢病毒表达载体pLV-MCS-Bsd中,构建出慢病毒表达载体pLV-PF447-70-RGD。其次,将构建好的慢病毒表达载体连同慢病毒包装系统的三个辅助质粒,共同转染293T细胞,进行慢病毒的包装生产,应用实时荧光定量PCR法(Realtime Quantitative PCR,Q-PCR)测定收获病毒的滴达6.16×107IU/ml。再次,将获得的空载慢病毒(pLV-MCS-Bsd)和重组慢病毒(pLV-PF447-70-RGD)分别感染人肺腺癌A549细胞系,在杀稻瘟菌素(Blasticidin,Bsd)压力下筛选出对应的稳定表达细胞系,然后在基因水平上通过RT-PCR,蛋白水平上通过Western Blot来检测PF447-70-RGD重组肽的表达。最后,进行体外活性实验,研究重组病毒转导的PF447-70-RGD基因功能及感染的A549细胞培养上清中分泌的重组肽的功能,即收集病毒颗粒和稳转PF447-70-RGD的A549细胞的培养液,用MTT法检测对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用,并观察稳转PF447-70-RGD的A549细胞培养液对HUVEC小管形成的影响。结果表明:实验组相对于对照组,能明显抑制HUVEC细胞增殖,抑制率为36.7%,而且能够显著抑制HUVEC细胞小管形成。


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