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基因组简化枯草芽孢杆菌的构建及应用

李杨  
【摘要】:本文以模式菌株Bacillus subtilis 168为研究对象,通过基因组连续删减操作,构建了一系列不同简化程度的基因组简化枯草芽孢杆菌菌株。研究了基因组简化操作对菌株形态、生理、遗传稳定性等方面的影响。在此基础上,以代表性基因组简化菌株作为底盘细胞,分别引入特定目标产物相关途径修饰,以此探究了基因组简化菌作为细胞工厂底盘细胞的特点和优势潜力。主要结果如下:利用无痕删除技术逐步删减去除了基因组上噬菌体区(pro 1~6,spβ,skin,PBSX),抗生素操纵子区(pps,pks)以及部分非必需基因区(ycxB-sipU,yisB-yitD,pdp-rocR,yrkS-yraK,yybP-yyaJ,ydeK-ydjC,lyt H–yurT,sboA-ywhH),获得一系列精简程度不同的基因组简化菌株,最多删减了845.6 Kb(精简20.1%)。基因组简化枯草芽孢杆菌菌株的生理特征发生了变化,在基本盐培养基培养条件下,基因组简化菌株生长速率下降,细胞得率提高,细胞自溶性下降,转化率、产孢率以及维持能系数都下降趋势。基因组简化菌株在微氧发酵培养条件下生长比对照出发菌株快,乙偶姻得率与对照菌株差别不大。通过引入acoA、bdhA缺失突变,与同等修饰的对照菌株相比,基因组简化菌株产乙偶姻的产量、得率有所提高。在基因组简化菌株BSK756、BSK814和出发菌株BSF1中,分别敲除了purA,过表达prs、purF和guaB,菌株BSK756、BSK814鸟苷产量分别是104.2 mg/L和115.2 mg/L,分别是对照菌株的4.1倍和4.4倍。以BSK756为对象,引入胸苷合成相关基因修饰(敲除tdk,过表达prs,并过表达E.coli来源的prs、ushA、thyA、dut和ndk),得到菌株BSK756T3,该菌株产胸苷151.2mg/l,相比于野生型菌株增长5.2倍,得率也有所提高。以菌株BSR0(Bacillus subtilis 168Δupp::spc,ribC*)为出发菌株进行基因组删减,与出发菌株相比,基因组简化菌株的核黄素略有增加。分别在基因组简化菌株BSR563和出发菌株BSR0引入过表达purF、purF置换以及强化表达核黄素操纵子等一系列遗传修饰,实验表明,与对照菌株BSR0R5相比,BSR563R5核黄素产量增长了77%,显示了基因组简化菌在代谢改造生产核黄素的优势。


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