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蛋白质色素亲和色谱理论研究

张松平  
【摘要】:利用活性色素Cibacron Blue 3GA (CB) 对不同来源的三种琼脂糖凝胶:6% agarose coated steel beads (6AS)、自制的4%-agarose凝胶粒子和Sepharose CL-6B进行修饰制得色素亲和吸附剂。选取牛血清白蛋白(BSA)、牛血红蛋白(Hb)和溶菌酶为模型蛋白,考察了液相离子强度、pH值以及固定化配基密度对蛋白质色素亲和吸附平衡和动力学的影响。 对于BSA吸附,一方面,增大离子强度可以削弱带有同种电荷的蛋白和色素配基之间的静电斥力,有利于BSA的吸附;另一方面,高的离子强度也使得色素配基和琼脂糖凝胶之间的疏水性相互作用增强,导致蛋白吸附可利用的配基数目减小,从而不利于蛋白的吸附。所以,存在一个最佳离子强度使BSA的吸附量最大。对于具有较小孔径的CB-6AS和CB-4% Agarose,最佳离子强度为0.2 mol·L-1,而对于具有较大孔径的CB-Sepharose,最佳离子强度为0.05 mol·L-1。 利用孔扩散模型对蛋白质吸附动力学进行拟合,求得蛋白质的有效孔扩散系数De。BSA在吸附剂内的De值随着液相离子强度的增大和\固定化配基密度的降低而增大,这主要是由于减弱了带有同种电荷的蛋白质扩散进入凝胶孔内所受的静电排阻作用。而对于具有较高等电点的血红蛋白和溶菌酶的吸附动力学,却几乎不受静电排阻作用的影响。 为了定量描述盐浓度对蛋白质色素亲和吸附平衡的影响,建立色素亲和吸附体系的空间质量作用模型(Steric mass-action model,SMA)。模型假设认为高盐浓度下疏水性蛋白(如BSA)吸附量的降低主要是由于配基和琼脂糖凝胶之间的强烈结合使得一部分配基倒伏在凝胶表面引起的。这种倒伏作用通过盐和配基之间的平衡来表示。同时结合SMA模型所提出的蛋白质吸附的多位点特性和大分子空间屏蔽效应的基本概念,得到了包括盐浓度为变量的SMA等温式方程。通过和实验结果相比较,该模型可以很好地用于预测任意盐浓度下BSA在CB-Sepharose上的单组分吸附平衡以及由BSA和Hb所组成的双组分混合体系的吸附平衡。考虑到盐浓度对碱性蛋白溶菌酶和疏水性蛋白BSA色素亲和吸附影响的机理不同,对上述建立的SMA模型进行修正,得到了用于预测盐浓度对溶菌酶吸附影响的平衡模型。 结合适当的传质模型方程,将SMA模型应用于色素亲和色谱过程模拟。该模型可以较好地预测非线性吸附条件下蛋白质的线性梯度洗脱过程。


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