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N-烷基化壳聚糖转基因载体的研究

孙光洁  
【摘要】:壳聚糖(2-氨墓—2-脱氧—?—D葡糖)是一种线性碱性多糖,具有独特的化学性质和生物特性。由于壳聚糖分子中含有活泼的烃基和氨基,可以进行多种化学修饰,因此其衍生物在生物医学工程领域有潜在的应用价值。 基于壳聚糖的生物相容性、可降解性和良好的跨细胞膜性,合成了亲疏水性可调,无细胞毒性的烷基化壳聚糖转基因载体。探索壳聚糖分子量、烷基取代度、不同烷基侧链等对配合物的形成和结构的影响,进一步研究其对基因转染率的影响,深化烷基化壳聚糖载体的跨膜机制,提高基因的缓释性和转染率。主要工作包括: 采用不同碳链长度溴代烷对壳聚糖改性制备了系列N-烷基化壳聚糖,并由红外光谱和X-射线衍射证实烷基确已引入壳聚糖分子,并使其分子结构发生改变,尤其是削弱了内部的氢键。研究了壳聚糖及其衍牛物的特性粘数和平衡溶胀度。烷基化壳聚糖的特性粘数随取代的烷基链长度的增加而降低。而烷基化壳聚糖的平衡溶胀度低于未烷基化壳聚糖。 以琼脂糖凝胶电泳考察配合物的形成,显示随着壳聚糖衍生物含量的增加,参与复合物的DNA含量提高,并在电荷比为1/4时出现极值。动力学光散射测试配合物单峰分布下的平均粒径主要分布在150nm左右。C2C12 细胞V790-20PC DNA 3.1载体体外转染实验表明烷基化改性的壳聚糖与DNA的复合物转染效率高于纯DNA及磷酸钙介导的转染率,接近阳离子脂质体。PIRES2-EGPF介导体外转染显示报告基因能在MCF7细胞中得以表达。 以荧光探针法测定了芘在壳聚糖及衍生物溶液中的发射光谱,并计算出其极性参数值I1/I3 。烷基化壳聚糖溶液的临界缔合浓度约8x10-2 mg/ml,表明引入烷基后壳聚糖的疏水性增加促进了自缔合的形成。示差扫描量热实验显示壳聚糖及衍生物同二棕榈酰磷酰胆碱之间强烈的相互作用,在其影响下DPPC的相转变焓随浓度增加明显减小


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