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从噬菌体肽库中筛选淀粉酶亲和配基的研究

吴云涛  
【摘要】:本文主要是从噬菌体七肽库中筛选α-淀粉酶的高亲和力配体,并把此高亲和力肽配体用固相多肽合成法进行了合成,最后把合成的肽配基固定在色谱柱上进行靶蛋白的亲和分离纯化研究。 实验采用α-淀粉酶为目标蛋白筛选噬菌体七肽展示库,在传统筛选法的基础上,采用了本研究室提出的新型筛选法-交替洗脱法,它主要是利用传统的酸洗脱法和靶蛋白轮流交替进行洗脱,并和传统的洗脱法进行了回收率和ELISA信号值的比较。证明该方法能够有效回收传统方法可能丢失的高亲和力配体,并具有快速和简便等优点。 在利用交替洗脱法筛选得到了α-淀粉酶配体后,选取了不同亲和力的多个噬菌体DNA进行了测序,并获得了相应的氨基酸序列。最后对不同亲和力肽段的序列进行比对,推测了和淀粉酶结合的关键氨基酸。 采用了Fmoc固相合成法合成了和淀粉酶亲和力最高的肽段,发现此肽序列容易形成副产物DKP。为了避免此副产物的形成,同时也不会使多肽丧失亲和性,实验对七肽进行了改造,并采用同样的方法进行合成,对于两种产物,分别从产品的收率和纯度上进行了比较,最后用质谱方法鉴定了序列的正确性。 合成的上述配体,用EDC法固定于琼脂糖凝胶基质上装填亲和色谱柱,并研究了α-淀粉酶在亲和柱上的吸附行为。通过调节流动相的pH值和离子强度,并使用了脲和乙二醇对α-淀粉酶进行洗脱,详细分析了不同调件时酶分子和肽配基的亲和吸附机理,最后发现静电作用、疏水作用和氢键作用共同构成了亲和吸附的主要作用力。


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