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基于基因组重排的产核黄素枯草芽孢杆菌的代谢工程

陈涛  
【摘要】:本文通过构建不同的整合型和游离型核黄素质粒得到一系列产核黄素 B.subtilis 基因工程菌,研究了核黄素操纵子的增加方式和剂量对枯草芽孢杆 菌核黄素合成的影响,成功地通过增加核黄素操纵子的剂量而稳定地提高工程菌 的核黄素合成能力,并通过两轮基因组重排改进了基因工程菌的生产性状。最后 本文建立了 B.subtilis 的生化反应网络,对第二轮基因组重排前后的三株 B.subtilis 产核黄素工程菌在间歇培养过程中的代谢通量分布作了比较分析。 得到的主要结果如下: 将整合型核黄素质粒分别以两种不同的整合方式在宿主菌染色体的 amyE、 thrC 和 rib 位点的进行整合,在整合方式的比较中发现双交换方式整合比单交换 方式整合更能有效地提高核黄素的产量。在整合位点的比较中发现:对于 B.subtilis RH13,以单交换方式在 amyE 位点整合对提高核黄素产量的效果要好 于其它两个位点;对于 B.subtilis 24R7,以单交换方式在上述三个位点进行整合 的效果基本相同。 基于基因扩增的原理,将解调节的核黄素操纵子在宿主菌染色体上进行不同 程度的扩增,结果表明:对于 B.subtilis RH13,通过扩增可以使核黄素产量由 0.43g/L 增加到约 3.0g/L,而当核黄素操纵子剂量超过 6-7 个时,核黄素产量不 能进一步得到提高。对于 B.subtilis 24R7,其染色体上的同向串联重复结构的稳 定性较差,通过 pRB63 的扩增仅使核黄素的产量增加约 70%。过多的核黄素合成 基因剂量对过量合成核黄素的菌株具有显著的生长抑制作用,甚至具有致死性。 对于 B.subtilis 24R7,转化入高稳定性的游离型核黄素质粒 pMX45 使核黄素的产 量从 1.1g/L 提高到约 3g/L。游离型核黄素质粒 pRB49 稳定性较差,转化入受体 菌株后并不能有效地提高菌株的核黄素产量。 本文基于基因组重排的原理来改进产核黄素工程菌的生产性状,通过两轮基 因组重排产生的 B.subtilis RH33/pMX45 在以蔗糖为碳源的间歇发酵条件下可产 核黄素 4.2g/L,比核黄素工业生产菌 B.subtilis 24/pMX45 的核黄素产量提高了 约 40%,并能更快地同化利用葡萄糖来合成核黄素,在以葡萄糖为碳源的间歇发 酵条件下可产核黄素 4.4g/L,约为 B.subtilis 24/pMX45 核黄素产量的 2 倍。 本文建立了 B.subtilis 产核黄素基因工程菌的生化反应网络及计量学模型, 模型共包括 34 个方程和 39 个变量。通过对第二轮基因组重排前后的三株产核黄 素 B.subtilis 在间歇发酵过程中的代谢通量分析表明:PP 途径的通量对核黄素合 成的影响不大,只有增加从 5-磷酸核酮糖到核黄素的一系列反应的代谢通量才能 有效地提高合成核黄素的通量。第二轮基因组重排后产生的 B.subtilis RH33/pMX45 中核黄素合成的主要通量限制因素存在于从 5-磷酸核酮糖到 GTP 的一系列反应中。


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