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酪蛋白多级结构及聚集行为的多尺度研究

章宇斌  
【摘要】: 酪蛋白是乳品中含量最高的蛋白质,也是乳品科学研究的核心。为了获得酪蛋白的多级结构信息及聚集行为特性,本文综合运用液质联用、圆二色、二阶紫外、光散射等多种现代分析技术,对α_s-、β-酪蛋白、全酪蛋白胶束的各级结构进行了多尺度系统研究,并对酪蛋白-胃蛋白酶体系的酶解过程进行了全面解析,主要工作如下: 酪蛋白单体分离及一级结构鉴定采用RP-HPLC、电泳、膜等分离方法,实现了对各酪蛋白单体的有效分离;运用ESI-MS对酪蛋白各单体进行质谱鉴定,确定了单体类型。 酪蛋白二级结构解析通过远紫外CD研究了不同pH及温度下α_s-、β-CN的二级结构变化规律,结果表明:加热导致α_s-及β-CN螺旋含量逐渐增加,且总体为热不可逆过程(pH8.0,β-CN例外),pH8.0时α_s-及β-CN具有更好的热稳定性;温度、乙醇、酯化影响实验表明酪蛋白胶束具有稳定的二级结构。 酪蛋白三级结构表征近紫外CD及二阶紫外对不同pH及温度下α_s-、β-CN三级结构的研究表明:随温度增加,各pH下芳香族氨基酸侧链总体上更易于包埋在疏水环境中,且该过程均不可逆,pH8.0时的三级结构均具有更好的稳定性;近紫外CD对酪蛋白胶束的研究表明其三级结构具有较好的热稳定性,在乙醇的作用下芳香族氨基酸侧链被逐渐包埋,而酯化则导致部分芳香族氨基酸暴露于极性环境中。 酪蛋白四级结构及聚集行为研究DLS对α_s-、β-CN的研究表明:加热导致其聚集,且随着pH增大,聚集能力减弱;SLS对酪蛋白胶束的分析得到了其基本构象参数;酪蛋白溶液的SEC-LS研究表明胶束与单体间存在一动态平衡;DLS测定了温度、浓度、溶液pH、磷酸盐离子强度、乙醇、阳离子浓度及酶解等因素对酪蛋白胶束尺寸及光强的影响,得到了其聚集/解聚行为规律。 酪蛋白的胃蛋白酶水解产物鉴定及历程解析利用HPLC-ESI-MS/MS技术分析了酪蛋白的胃蛋白酶水解产物,鉴定了主要产物多肽的一级序列及释放规律。利用DLS及SEC-LS得到了酪蛋白酶解过程中胶束尺寸和分子量的变化规律,并得到了产物分子量分布,同时解析了水解产物中五类特定分子量片段的释放动力学历程。


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