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白念珠菌和酿酒酵母菌与TOR信号传导相关的基因功能鉴定

闫智慧  
【摘要】: 蛋白激酶TOR(Target of Rapamycin)的功能在真核细胞内是非常保守的。酿酒酵母细胞中TOR由TOR1和TOR2两个基因编码,以两种不同的复合物形式存在——TORC1(TOR complex 1)和TORC2(TOR complex 2)。白念珠菌基因组中只存在一个编码TOR的基因。我们发现白念珠菌基因组数据库CGD(http://www.candidagenome.org/)中给出的CaTOR1基因的ORF序列中存在两个断裂的部分。我们分别对断裂的部分进行了克隆并测序,获得了完整的CaTOR1基因序列。我们采用URA-blaster敲除盒同源重组的方法成功得到白念珠菌CaTOR1单等位基因缺失菌株,但是却不能获得其双缺失菌株,表明CaTOR1基因可能是一个必需基因。CaTOR1单等位基因缺失菌株和背景菌株RM1000相比,表现出对雷帕霉素的敏感,但是对Li+、Na+、K+和Ca2+盐离子不表现敏感性。在4mM的H2O2氧化胁迫、高温(40℃)、CFW和Congo red存在的条件下,CaTOR1单等位基因缺失菌株和背景菌株RM1000相比无生长差异。在含有不同碳源的YPD、YPE和YPG平板上与RM1000也无生长差别。此外,白念珠菌中CaTOR1单等位基因缺失不影响细胞在菌丝诱导条件下(如SLAD、Spider和YPD+ serum)形成菌丝的能力。 我们首次发现缺失编码TORC1组分之一的酿酒酵母ScTCO89基因的细胞表现出对Li+和Na+离子的敏感性,这与报道的ScTOR1基因的缺失引起Li+和Na+离子的敏感性的研究结果相互支持,因为编码Li+和Na+盐离子转运蛋白的ENA1基因受TOR信号转导途径的调控。 我们还发现缺失编码PP2C磷酸酯酶的酿酒酵母基因PTC1或PTC6的细胞均表现出对雷帕霉素的敏感性。在ptc6酵母细胞中引入含有PTC6基因的单拷贝pRS316-YCR079w质粒可以恢复ptc6酵母细胞的雷帕霉素耐受性,引入含有PTC6基因的多拷贝pRS426-YCR079w质粒则可以提高雷帕霉素的抗性,结果说明PTC6基因是一种与雷帕霉素抗性有关的基因。


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