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RNAi介导的pds基因沉默及其对光合作用的影响

汪敏  
【摘要】: 光合作用中能量的吸收、传递和转化是光合作用研究的首要问题,类胡萝卜素在光合作用中起着至关重要的作用,它们是光能的吸收与传递和光反应中心的重要结构成分。类胡萝卜素既是重要的辅助色素,帮助叶绿素接收光能,它们在高温、强光下还能通过叶黄素循环,以非辐射的方式耗散PSII的过剩能量,保护反应中心、天线色素蛋白复合物、Chl等免受破坏。其数量的变化必将给光合作用带来影响。 通过提取烟草叶片总RNA,用RT-PCR技术扩增了PDS-CDS序列的340 bp片段,构建了中间载体pUCCRNAi-sense、pUCCRNAi-sense-intron- antisense和含有sense-intron-antisense片段的表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS-sense-intron–antisense。用农杆菌介导的方法对烟草进行转化,得到了有卡那霉素抗性的转基因烟草。烟草叶片发生了不同程度的白化,且随着生长,白化现象逐渐加强。通过烟草基因组PCR检测和半定量RT-PCR分析,证明转基因烟草的pds基因表达受到抑制,白化越明显,抑制程度越高。转基因烟草花色未发生改变。 对烟草的光合作用进行了研究,对不同程度白化的烟草叶片的色素含量进行测定,发现pds基因沉默引起了总类胡萝卜素含量的下降。且随着类胡萝卜素含量的降低,Chl a和b的含量也下降,但是Chl a/b比值保持不变。超微结构的分析表明斑驳叶片的绿色部分叶绿体完整,类囊体排列整齐,且基粒片层清晰,类囊体垛叠与野生型烟草没有区别。斑驳叶片的白色部分和完全白化的叶片中均出现白色体,没有类囊体的垛叠。叶绿素荧光动力学分析结果显示,在300μmol photons m~(-2) s~(-1)的光强下,与野生型烟草相比,pds沉默的烟草Fv'/Fm'和qP显著下降,而qN升高。而在800μmol photons m~(-2) s~(-1)光量子强度下,Fv'/Fm'从正常生长条件下的0.72下降到0.56,而转基因烟草从0.49下降到0.43。与野生型相比,转基因烟草的qP降低,而qN升高。用温和电泳方法分离了光系统的色素蛋白复合物,对其进行吸收光谱、色素组成、蛋白组成分析,发现转基因烟草各复合物在吸收光谱、色素组成方面与野生型烟草无差异,只是在相同色素浓度情况下,LHC II含量有所增加。以上结果显示,单位蛋白复合物上的色素数量减少,色素分子间的距离增加,电子传递受到影响,PSII活力受到抑制。对转基因烟草抗氧化酶含量进行测定,发现转基因烟草叶片SOD活力均显著降低,而POD活力在轻微白化叶片中显著上升,严重白化叶片的POD活力与野生型无显著差异。


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