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微生物发酵生产壳聚糖及酶法降解壳聚糖研究

刘珍利  
【摘要】:壳聚糖(Chitosan, CTS)是自然界已经发现的唯一的天然高分子碱性多糖,是甲壳素脱乙酰基产物。CTS具有独特的生理活性和良好的成膜性、保湿性、吸附性和抗菌性,具有广泛的应用价值。壳聚糖降解产物低聚壳聚糖(Chitosan Oligosaccharides, COS)的水溶性大大改善,具有许多壳聚糖所不具备的独特的生理活性和功能。本论文对如何利用真菌发酵生产壳聚糖,并用非专一性酶降解壳聚糖制备低聚壳聚糖进行了研究。 论文首先对几种常见真菌培养生产壳聚糖进行了研究,确定雅致放射毛霉为发酵制备壳聚糖优良菌种。通过单因素和响应面实验优化了雅致放射毛霉液体发酵培养基的组成和发酵条件。研究表明:发酵培养基优化后的组成为玉米浆6.8%、玉米粉4.2%、KH2PO40.2%、MgSO40.2%;优化的发酵条件为培养时间48h、培养基初始pH7、培养温度30℃、摇床转速200r/min、接种量4%、装液量50ml/250ml。 其次,采用稀酸稀碱处理菌体提取壳聚糖,对提取工艺路线和参数进行了优化。先用4%氢氧化钠,固液比1:30,115℃处理4h除去菌体表面蛋白,再用4%醋酸60℃下提取3h,壳聚糖得率可达到13.48%。采用优化后的发酵条件和提取条件,壳聚糖产量可达4.152//L,脱乙酰度为90.25%,粘均分子量为2.1×105。 此外,论文选用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对壳聚糖进行酶解,以酶解液中还原糖浓度为指标,通过单因素实验考察这四种非专一性酶对壳聚糖的酶解效果。结果表明:各酶降解壳聚糖的能力大小为:纤维素酶胃蛋白酶果胶酶木瓜蛋白酶。采用正交实验优化纤维素酶和胃蛋白酶组成的复合酶酶解条件。结果表明:优化后的酶解条件为pH5.5,温度为65℃,胃蛋白酶量为3U/mg,纤维素酶量为3U/mg。在优化后的条件下还原糖的浓度可以达4.64mmol/L,均高于单一的纤维素酶和胃蛋白酶的酶解效果。 最后,对酶解产物进行了SephadexG-25凝胶色谱分析和薄层层析。凝胶色谱分析洗脱曲线显示酶解产物中含主要含有低聚壳聚糖和氨基葡萄两个洗脱峰。酶解产物薄层层析表明酶解产物中低聚壳聚糖是由两种分子量的低聚糖组成。此外,通过薄板层析割胶法回收低聚壳聚糖和氨基葡萄糖,回收率分别为54%和22%。


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