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多杀菌素高产菌株的诱变育种和发酵工艺优化

李丽  
【摘要】:多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌发酵产生的次级代谢产物,主要由两种具有显著杀虫活性的物质Spinosad A和Spinosad D组成,属大环内酯类抗生素。由于多杀菌素兼具生物农药的安全性和化学合成农药的速效性特点,在农业生产和粮食储臧中具有良好的应用价值和广阔的市场前景。本文通过化学诱变选育获得多杀菌素产量提高的菌株,并对其生长和代谢特性进行研究,同时进行了摇瓶发酵工艺优化。主要结论如下: 1、通过两次NTG诱变,获得遗传稳定高产菌株1株,多杀菌素产量比出发菌株的多杀菌素产量最高提高了28%。 2、通过考察10种固体培养基对刺糖多孢菌生长快慢、菌落形态大小和产孢丰富度的影响,确定了5种菌体生长迅速,产孢丰富的固体培养基。在此基础上进行了4℃低温保藏试验,确定了一种短时间内不易引起菌株发生变异的固体培养基。配方为:酶解酪蛋白0.2%, Yeast extract0.3%, MgSO4·7H2O0.2%,葡萄糖1%,琼脂2%。 3、通过对刺糖多孢菌的种子培养基、培养温度、培养基装量、摇床转速和添加玻璃珠个数进行研究,同时运用Gompertz模型拟合其生长曲线,最终确定当培养温度为29℃,摇床转速240r/min、玻璃珠6个、培养基装量30mL/250mL时,种子培养基可获得最大生物量。 4、考察了碳源对多杀菌素合成的影响,并通过响应面试验确定了高产菌株N8-30-37的最佳发酵培养基:葡萄糖6.5%,可溶性淀粉8.5%,棉籽蛋白2.8%,蛋白胨2%,硝酸铵0.09%,氯化钠0.3%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸亚铁0.005%, CaCO30.5%, pH7.2,该最佳发酵培养基的多杀菌素产量比对照提高了100%,产量达410.25μg/mL。 5、以摇瓶发酵试验为基础,进行100L发酵罐放大培养,发酵单位为84.36μg/mL,产量较发酵罐低。


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