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解脂酵母中POX3基因的敲除研究

师慧敏  
【摘要】:γ-癸内酯(γ-GDL)是一种具有桃子味道的香味物质,在自然界中存在很少,主要用于配制桃子、椰子、奶油和柑橘型的香精。为构建一株高产γ-癸内酯的解脂酵母,本论文尝试通过基因敲除手段灭活pox3基因来提高γ-癸内酯的产量。 从SGD和NCBI数据库上获得pox3和pUG6质粒的序列,设计了两对嵌合引物以及两对验证引物。由嵌合引物通过扩增pUG6质粒中的loxP-kanMX-loxP序列组件产生pox3基因敲除序列组件。将pox3基因敲除序列组件转化至酵母细胞后,分别与pox3序列上下游同源的60bp序列引发同源重组事件,最终以loxP-kanMX-loxP取代基因组中的pox3并赋予转化子G418抗性。经菌落PCR验证为阳性转化子后,进一步转化携带可赋予细胞Zeocin抗性的bler标记基因的质粒pSH65,并在含半乳糖的培养基中诱导pSH65表达Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组,移除质粒pSH65后获得了pox3基因缺失突变株。对其进行生长曲线以及发酵实验的分析,突变菌株与原始菌株相比在生长速率方面无显著差异。发酵实验结果表明,突变株的DECA产量最高为1.13g/L,原始菌株DECA产量为1.16g/L。因此,单基因的敲除并未对提高产量产生显著影响。 目前在国内,以Cre/loxP系统为基础的基因敲除法主要运用于酿酒酵母的基因改造中,在解脂酵母中未见此类报道。因此本研究在解脂酵母的基因工程改造方面进行了有益的探索


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