大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pBE2R的构建及应用

【摘要】：本文构建了一个可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中稳定复制,并可以在枯草芽孢杆菌中表达外源蛋白的穿梭表达载体pBE2R。该穿梭表达载体是以pBE2为基本骨架,引入来自pWB980质粒的P43强启动子,并在其下游引入嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽和前肽构建而成。质粒拷贝数测定结果显示,pBE2R在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌每个细胞中大约含有1个拷贝。质粒稳定性实验结果显示：该质粒在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中各传30代而不发生丢失,说明该质粒在本实验条件下,可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中稳定存在。 利用pBE2R可以实现碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达。以嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因组为模板,据GeneBank报道的碱性蛋白酶基因序列,设计引物,采用PCR技术扩增碱性蛋白酶成熟肽编码基因。连接成熟肽基因与pBE2R,连接产物转化大肠杆菌,提取阳性转化子中质粒转化枯草芽孢杆菌WB600。实验结果显示：嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶可以成功地在枯草芽孢杆菌中进行分泌、表达。 pBE2R含有来自枯草芽孢杆菌的P43重叠启动子,可以有效提高外源蛋白的表达量。启动子下游连接有碱性蛋白酶信号肽和前肽编码基因,实验结果表明,信号肽部分可以有效地引导翻译后的外源蛋白完成跨膜分泌；前肽部分作为分子内伴侣,它的存在及其在胞外的正确切除对外源蛋白的折叠,稳定性及功能的发挥起着重要的作用。实验发现,碱性蛋白酶前肽3’末端的一段氨基酸序列‘'TTMA'(从第108位到第111位氨基酸)及其排列顺序对前肽的正确切除起着至关重要的作用,保持TTMA"序列的完整性是前肽正确切除必要条件之一。这一发现为胞外蛋白前肽切除机制的研究奠定了一定的理论基础。 pBE2R不仅可以使外源蛋白在枯草芽孢杆菌进行分泌表达,而且也为碱性蛋白酶定向改造提供了高通量筛选平台。将经易错PCR和DNA Shuffling技术获得的碱性蛋白酶成熟肽突变基因与pBE2R连接,连接产物转化大肠杆菌,获得大量克隆,提取其中质粒转化枯草芽孢杆菌,采用酪蛋白平板进行初筛,结合液体发酵液的分光光度法(96孔板)进行复筛,如此重复,经多轮改组和高通量的筛选,最终获得理想的碱性蛋白酶突变基因。 据中温α-淀粉酶(来自枯草芽孢杆菌BF7658)利用pBE2R在枯草芽孢杆菌WB600中表达的实验结果推断,碱性蛋白酶长前肽在指导短前肽类蛋白形成功能蛋白方面存在一定的局限性。