嗜热链球菌发酵中酸性相关基因的筛选与分析

【摘要】：嗜热链球菌是重要的工业微生物菌株,革兰氏阳性菌,兼性厌氧。乳酸菌发酵的酸奶在食用前会经过贮存、运输,在这个过程中细菌会继续生长繁殖产生后酸化现象,出现人们难以接受的过酸味。这一问题一直困扰着很多企业生产者和研究者。因此研究参与调控嗜热链球菌产酸、耐酸相关的基因具有重要意义。 根据嗜热链球菌在12%脱脂乳发酵过程中的pH变化及产酸速率变化曲线的拟合结果,先确定了四个与产酸、耐酸有关的点,点1：发酵20-45min；点2：发酵110-130min；点3：发酵pH4.6；点4：发酵24h。本文利用转录组学方法对这4个点的转录组学进行了分析,并将点1作为参照,其它点与点1相比较进行嗜热链球菌产酸、耐酸相关基因的分析。对1962个表达的基因进行了比较：样2与样1比较共发现115个基因的表达量发生变化,其中有65个基因表达上调,50个基因表达下调；样3与样1相比较有104个基因的表达量发生变化,其中33个差异性表达上调的基因,81个差异性表达下调的基因；样4与样1相比较有125个基因的表达量发生变化,其中43个基因表达上调,82个基因表达下调。分析发现,ptsG在嗜热链球菌对葡萄糖的利用中起着一定的作用,也可能参与某些代谢的调控作用。AtpF编码的蛋白质在酸耐受性中起着重要的作用。双组份体系、Nudix家族水解酶和XRE家族调节因子在酸耐受上也起着重要的调节作用。选择了部分差异性表达的基因进行RT-qPCR的验证。在样2与样1比较的基因表达量的变化中,在发酵对数初期,Y1U_C1378、Y1U_C1466、 Y1U_C1888基因的表达量较发酵初始阶段的基因表达量的变化倍数分别是1.22、1.51、2.22倍,和转录组的结果一致,均为表达量上调。在发酵对数末期,Y1U_CO179、 Y1U_CO462、Y1U_C1378基因的表达量较发酵初始阶段基因表达量的变化分别为3.01、6.19、1.48倍,与转录组结果一致,均表达量上调。为了进一步验证基因在产酸与耐酸中的作用,利用同源重组对目的基因进行敲除,成功构建了基因敲除质粒pMD18-T:XRE:Cl和pMD18-T:gly:Cl。该研究为菌株的改造提供了一定的理论基础。