3-羟基丙醛影响克雷伯氏菌代谢及基因工程菌的构建研究

【摘要】：1,3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料,其最主要的用途是合成性能优异的新型聚酯聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的重要单体,近年来,以生物柴油的副产物甘油生产高附加值的1,3-丙二醇,已成为提升生物柴油产业链经济性的重要途径。 本论文从3-羟基丙醛(3-HPA)积累对克雷伯氏菌生理代谢的影响入手,探讨了3-HPA对克雷伯氏菌PDO代谢的影响。当甘油浓度为70g/L时,高浓度3-HPA积累,导致发酵异常终止。盐酸氨基脲可诱导3-HPA的合成,考察了不同浓度盐酸氨基脲对克雷伯氏菌发酵的影响。低浓度盐酸氨基脲可以诱导发酵过程中3-HPA浓度有小幅度提高,并促进克雷伯氏菌菌体生长；当盐酸氨基脲浓度高于10mmol/L,3-HPA在发酵液中高浓度积累,发酵异常终止。 本文还考察了3-HPA积累对克雷伯氏菌PDO合成关键酶及辅酶的影响。在高浓度(7.05mmol/L)3-HPA积累时,甘油脱水酶活力较低浓度时(2.45mmol/L)提高一倍,甘油脱氢酶活力降低了33.33%,PDO氧化还原酶活力降低37.5%。因此,细胞内3-HPA合成速率加快,而被转化为PDO的速率降低而导致3-HPA积累。在高浓度3-HPA积累时,发酵液中NADH2仅为低浓度3-HPA时的38.49%,同时NAD+升高了43.36%,还原力不足也是导致PDO合成受阻,发酵终止的另一重要原因。 在考察了3-HPA积累对克雷伯氏菌生理代谢影响的基础上,以提高克雷伯氏菌对3-HPA耐受性为思想基础,将聚羟基丁酸路径引入克雷伯氏菌中,构建了新型基因工程菌,在发酵过程中,经IPTG诱导,工程菌中检测到了PHB,优化的IPTG诱导浓度为0.5mmol/L。初始甘油浓度为70g,/L时,野生菌由于高3-HPA积累而发酵终止,而工程菌K.P/pCAB可耐受高浓度3-HPA,正常发酵生产PDO。发酵72h时,PDO产量可达31.30g/L,较野生菌增加了39.71%,其PDO得率为43.89%。 本研究有助于加深对克雷伯氏菌1,3-丙二醇代谢机理的认识,为克雷伯氏菌的进一步优化提供了新的思路。