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饲用β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质的研究

张文会  
【摘要】:酶制剂作为一种绿色环保的添加剂已在饲料行业中得到广泛的应用。其中常用的β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶对提高饲料的转化率、节约饲料资源、降低饲料成本和改善饲养环境等起着的重要作用,因此得到广泛的关注。然而目前已发现的大部分β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶由于产量低、酸稳定性差,并且容易被动物肠道中的蛋白酶降解,很难在实际应用中发挥理想的效果。因此筛选具有耐酸、抗蛋白酶特性的新型饲用酶制剂并在特定宿主中实现高效功能表达具有重要的意义。为获得具有抗蛋白酶特性的β-甘露聚糖酶,本研究从一株蛋白酶高产枯草芽孢杆菌中分离得到一种β-甘露聚糖酶,并对该酶的编码基因进行了克隆,同时在大肠杆菌Escherichia coli Rosseta(DE3)和毕赤酵母Pichia pastoris GS1 15 中实现了高效异源表达和酶学性质分析。研究结果显示:该β-甘露聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适pH值为5.5,在pH3-10的范围内均较好的催化活性。金属离子Hg2+和Ag+,表面活性剂SDS,吐温20,TritonX-100对该β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用,而Zn2+,Co2+,Cu2+,Fe3+则对该酶有明显的激活作用。稳定性研究表明:采用pH 2.0的酸性缓冲液处理1h后,残余酶活仍能保持70%以上;进一步采用40U/mL的胰蛋白酶处理2h,残余酶活仍在60%以上,表明该酶不仅具有较好地酸稳定性,还对来源于猪胰腺的蛋白酶具有一定的抗性。该β-甘露聚糖酶在大肠杆菌以及毕赤酵母中均可实现功能表达,但在Pichia pastoris GS115中的功能蛋白表达量较高;摇瓶发酵条件下,甲醇诱导72h,β-甘露聚糖酶产量可达427 U/mL;进一步采用5L发酵罐,甲醇诱导高密度发酵技术,β-甘露聚糖酶产量最高可达8261.21 U/mL,可初步满足现代规模化生产的需求。本研究还对来源于黑曲霉的α-半乳糖苷酶的编码基因进行了克隆,并在P.pastoris GS115中实现了高效表达,但表达量较低,摇瓶发酵条件下,甲醇诱导72 h,发酵液中的酶活仅为12 U/mL。因此需要进一步的研究来提高α-半乳糖苷酶的表达量,比如选择适当的表达宿主等。


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