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基因工程大肠杆菌的甲醇利用研究

王晓璐  
【摘要】:甲醇是结构最简单的饱和一元醇,重要的有机化工原料。我国甲醇产能国际领先,呈现过剩趋势,甲醇经济的发展急需配套的甲醇转化利用技术。甲醇价格低廉,碳还原程度高,是生物化工中糖质原料的理想替代原料。甲醇的生物利用可分为甲醇同化和甲醇异化,甲醇同化可为细胞生长代谢提供能量和碳骨架,甲醇异化可将甲醇完全氧化成CO2,为生物合成提供大量还原力。天然存在能利用甲醇的微生物遗传操作困难,因此以常用工业菌株如大肠杆菌(Escherichia coli)为平台,赋予其甲醇利用能力,是实现甲醇生物转化利用的重要路线之一。本课题分别针对甲醇同化和甲醇异化展开研究,一方面构建可同化甲醇的E.coli,另一方面打通甲醇异化为生物合成提供还原力的路径,丰富甲醇生物转化利用的模式。首先,本课题结合代谢工程和适应性进化的方法,构建可同化甲醇的E.coli。本课题选择了一系列甲醇利用相关基因,在E.coli中构建了两条甲醇同化途径:由甲醇脱氢酶和甲醛缩合酶组成的甲醛缩合途径,以及由甲醇脱氢酶、磷酸己酮糖合酶和磷酸己酮糖异构酶组成的磷酸核酮糖途径。之后在基因工程菌中引入了dnaQ基因突变体,使菌株DNA复制过程中的矫正功能缺陷,通过连续传代和适应性进化引入随机突变,并结合甲醇作为碳源的压力筛选,得到了可以利用甲醇生长的突变株。酶活检测结果表明,突变株的甲醇同化途径关键酶活性得到提高。通过使用13C标记甲醇作为底物,结合蛋白质合成氨基酸的质谱检测,证明13C标记的甲醇进入了细胞代谢途径,并用于合成细胞碳骨架。其次,本课题还异源表达并纯化了甲醇异化途径的关键酶甲醇脱氢酶、甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶,在体外构建了甲醇完全氧化生成CO2的异化途径。通过偶联D-乳酸脱氢酶,利用甲醇异化产生的NADH驱动丙酮酸到D-乳酸转化,成功打通了甲醇异化为生物合成提供还原力的路径。计算表明,D-乳酸生成速度约为甲醇消耗速度的3倍,说明1分子甲醇完全氧化生成的3分子NADH全部用于供给D-乳酸合成。本课题针对甲醇同化和甲醇异化分别展开研究,通过代谢工程和适应性进化获得了可利用甲醇合成细胞碳骨架的E.coli;通过纯酶催化打通了甲醇完全氧化为生物合成提供还原力的路径,为甲醇生物转化利用研究提供了参考和应用实例。


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