渤海石油烃降解菌的分离鉴定及基因组学分析

【摘要】：渤海湾海洋环境常常受到石油污染的影响,石油降解菌在石油污染生物修复技术中起到非常重要的作用。本研究分别以渤海湾油污区采集的水样,油样,水油泥混合样为材料富集分离石油降解菌,对其进行生理生化及分子生物学鉴定,并采用GC-MS内标法测定烷烃、环烃、芳香烃等石油烃组分的变化。从中选出高效石油烃降解菌,分别于3d、6d、9d测定其降解率,同时测定其生长状况,对其生长与降解趋势之间的关系进行研究。采用Pacbio单分子实时(SMRT)测序技术对高效降解菌株进行全基因组测序,将测序数据进行基因组Denovo组装,获得基因组完成图信息,再对所得模板进行校验和修正,得到精确的基因组序列。采用细菌基因模型预测主流软件Prodigal,对全基因组进行基因模型预测,获得基因模型的位置信息和氨基酸序列等信息,将预测得到的基因组编码区氨基酸序列,与COG等数据库进行同源序列比对,获得基因的功能描述以及后期数据分析的基础信息,并对菌株中的降解基因进行分析。结果表明,从不同油污区的水样、油样、水油泥混合样中共得到28株可降解石油的菌株,经过多次富集培养及分离纯化,最终筛选出降解效果较好的3株菌,分别为Tust-DW04、Tust-DC12、Tust-DM21。菌株16SrDNA序列分析表明它们均与不动杆菌属(Acinetobacter)有99%序列相似性。GC-MS分析表明3株菌对石油均有较好的降解能力,降解10d后,其对烷烃的降解率为74%-98%,对芳香烃的降解率为74%～88%,对环烃的降解率为63%～88%,3株菌的石油烃降解能力依次为Tust-DM21Tust-DC12Tust-DW04,对石油烃的降解效果依次为烷烃芳香烃环烃。其中菌株Tust-DM21为一株高效石油烃降解菌,富集培养10d后,其对烷烃(C10～C30)的降解率可达98%,对芳香烃和环烃的降解率达88%,且菌株的生长与降解能力呈正相关,在稳定期菌株的降解率达到最高。菌株Acinetobactersp. Tust-DM21由2个环状基因组及3个环状质粒组成。在该菌基因组中发现了 168个可能参与石油烃降解的基因,其中基因组g1中发现有56个降解基因,基因组g2中发现有95个降解基因,质粒1中发现17个降解基因。基因组分析表明,Acinetobactersp. Tust-DM21中与石油烃降解有关的基因主要有烷烃降解基因AlkB与细胞色素P450,主要的芳烃降解基因为儿茶酚1,2-双加氧酶与α亚基苯1,2-双加氧酶。对Tust-DM21基因组中编码降解烷烃的乳醛脱氢酶代谢途径分析表明,其主要参与烷烃、醇类、烯烃降解及萘降解代谢途径,以及次生代谢物的生物合成过程,推测乳醛脱氢酶很有可能对Tust-DM21的生物降解中直接脱氢氧化过程发挥重要作用。Acinetoaactersp. Tust-DM21菌株对烷烃,环烃,芳香烃都有较强的降解能力,是一株具有较好应用开发前景的石油降解菌。