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利用粘红酵母转化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸的研究

张文博  
【摘要】: L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人体和动物不能自身合成的必需氨基酸之一。苯丙氨酸广泛应用于食品加工、饲料添加剂、医药等行业中。L-苯丙氨酸与天冬氨酸缩合制成的二肽甲酯天冬甜肽目前已被多个国家获准销售。这种甜味剂的广阔市场使苯丙氨酸的需求量不断加大。天冬甜肽最近被证实具有提神醒脑及减肥等功效,更加促进了苯丙氨酸的市场需求。 采用合成培养基,确定了粘红酵母产酶模式为滞后合成型,研究了苯丙氨酸解氨酶的产酶动力学,建立了产酶动力学的数学模型,方程式为:dE/dt=βX。研究了参数β的简便求法及意义。分析了影响产酶动力学参数的因素,发现诱导物添加时间、添加量等因素都影响产酶动力学方程的参数β。 基于对粘红酵母PAL产酶动力学方程的分析,优化了影响方程参数的因素。菌体在第18小时达到最大出芽率。此时转接,菌体在产酶培养基中生长与产酶情况最好。通过单因子实验与正交实验优化得到的最佳天然培养基配方为(g/L);葡萄糖0.4,酵母膏8.0,玉米浆30.0,NaCl 5;KH_2PO_4 1。七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁、六水合硫酸锰等无机盐对于菌体生长与产酶皆无明显影响。0.10g/L钼酸钠能够促进粘红酵母的生长。1.0g/L K_2HPO_4对于促进菌体生长的效果优于1.0 g/L KH_2PO_4的效果。D-苯丙氨酸对于PAL的产生具有安慰诱导作用。菌龄为8h时添加诱导物,诱导物由终浓度为0.40g/L的L-Tyr与0.10g/L的DL-Phe组成。通过产酶条件优化,最终使得酶活力增加了75%,非生长偶联的比产酶速率提高了122%,生物量提高了5.4%,培养时间缩短了45%。 通过单因素实验和正交实验优化了转化条件。转化液成分优化为5.6mol/L[NH_4~+]、14.5%[HCO_3~-]并调pH10.5(t-Ca浓度为0.1%)。选择0.05 g/L氯化十六烷基吡啶加入转化液中可以促进转化反应。 研究了谷氨酸钠、海藻酸钠、聚乙二醇、甘油、锌粉、氮气对PAL稳定性的影响。通过单因子实验和正交实验,优化确定在底物反应液中添加1.0g/L锌粉和20.0g/L谷氨酸钠。最终,苯丙氨酸积累浓度提高到27.52~31.90g/L。


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