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木质素过氧化物酶基因表达载体的构建及其在甲醇毕赤酵母中的表达

孙亚范  
【摘要】:木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,Lip)是一种由黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)分泌的单血红素糖蛋白。利用黄孢原毛平革菌生产木质素过氧化物酶受到许多因素的限制。例如:只有在限氮或其它不均衡的培养基中才能分泌木质素过氧化物酶并且酶活较低,同时其菌丝在发酵罐中易受高剪切力的损伤。 本论文以黄孢原毛平革菌5.776为出发菌株,研究了lipH8基因在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中的表达。 采用TRIZOL试剂提取黄孢原毛平革菌RNA,以此RNA为模板,通过RT-PCR技术进行体外扩增,得到了去掉自身信号肽的木质素过氧化物酶基因(lipH8);将lipH8基因克隆至载体pUC19,获得克隆载体pUC19-lipH8,转化大肠杆菌DH5α;经序列测定确认所得到的基因与报道的木质素过氧化物酶基因序列完全一致。 将测序确认正确的lipH8克隆至甲醇毕赤酵母整合型表达载体pMETα.A,获得酵母表达质粒pMETαA-lipH8;表达质粒pMETαA-lipH8经线性化后,采用电转化法转化Ade缺陷型甲醇毕赤酵母PMAD16;通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETαA-lipH8对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法;确定最佳电转化参数为:采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞(菌体OD_(600)为1.0-1.2),感受态细胞冻存时间不超过3周,质粒DNA的浓度30μg/mL,场强为3kV/cm,最高转化率为57个转化子/μg质粒DNA;通过MD平板、PCR方法筛选和鉴定转化子:转化子发酵液经SDS-PAGE分析和木质素过氧化物酶活力测定等方法鉴定,表明去除自身信号肽的黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(lipH8)在甲醇毕赤酵母中得到表达。 通过摇瓶进行转化子表达条件优化,确定工艺参数为:摇瓶培养时间为72h;发酵培养基组成为(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,生物素4×10~(-4),0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)。诱导剂甲醇的浓度为0.5%,装液量为三角瓶体积的10%,接种量为10~9个/瓶。以藜芦醇为底物进行酶活测定,得到最高胞外木质素过氧化物酶活力为1997U/L,较出发菌株(899U/L)提高了122.1%;其发酵指数为22.69U/h.L,较出发菌株(6.24 U/h.L)提高了263.6%。


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