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肺炎克雷伯氏菌荚膜免疫活性物质的研究

张燕  
【摘要】:论文采用临床分离的具有国内肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)血清型流行特征的Kp CGMCC No.1000株,对其荚膜免疫活性物质CIA的微生物高效表达条件,制备工艺以及生物活性进行了系统研究,分离纯化了荚膜多糖CPS,以慢性髓系红白血病K562细胞为模型,对CPS诱导肿瘤细胞凋亡进行了初步研究,并对其一级结构进行了表征。 首先建立了对Kp荚膜免疫活性物质的间接ELISA检测法,该法的检测灵敏度为0.031μg/mL,线性检测范围为2.5μg/mL~30.0μg/mL,其精密度和准确度均能满足检测方法的要求,适用于Kp荚膜免疫活性物质样品的大批量、快速检测;同时建立了Kp全菌ELISA检测方法,该法与菌体荚膜免疫活性物的间接ELISA法的检测结果呈正相关性,为发酵工艺优化提供了重要评价指标。 确立了最适Kp生长和CIA表达的发酵条件及CIA制备工艺。最佳培养基为(g/L):蔗糖40,胰蛋白胨20,酵母粉1,K_2SO_4 1,MgSO_4 0.25,KH_2PO_4 4,Na_2HPO_4 3,pH6.0;最适摇瓶培养工艺:接种量2%,种龄5h,500mL挡板瓶装液量16%,摇床转速150r/min,37℃培养3.5h。发酵液经胰蛋白酶结合NP40和溶菌酶共同作用快速裂解菌体;裂解液经中空纤维膜超滤,浓缩和纯化目标产物;并利用CTAB结合NaCl的方法去除浓缩液中的核酸,最后经乙醇沉淀得CIA。 先后经CTAB特异吸附分离,弱碱型阴离子交换和凝胶过滤纯化制备了荚膜多糖CPS,利用葡聚糖凝胶层析和琼脂糖凝胶电泳两种方法验证了CPS的相对均一性。通过各种物理和化学分析证明,CPS为连接有肽链的含有大量糖醛酸的多糖复合物,同时可能结合有少量DNA;摩尔质量为109194.3;CPS连接的肽链由17种氨基酸组成,占CPS总质量的2.98%;CPS糖链含有核糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸,且单糖间具有1→6糖苷键连接;糖链与肽链之间以O-糖肽键相连;同时CPS存在呋喃和吡喃两种糖环,并具有α,β两种糖苷构型。 以慢性髓系红白血病K562细胞为模型,研究了CPS诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果表明CPS对K562细胞有明显的抑制作用,可引起细胞形态上明显的凋亡变化,细胞周期分析表明,CPS能引起K562细胞周期的变化,诱导凋亡,并且凋亡程度随CPS浓度的增加,作用时间的延长而增强。 体外免疫活性研究显示CIA能加速B和T淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬


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