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碱性果胶酶的发酵条件研究及酶的分离纯化

张保国  
【摘要】:从碱性土壤中分离得到一株高产碱性果胶酶的菌株S-2,对该菌株进行形态特征和生理生化鉴定,确定其为革兰氏阳性,杆菌,有芽孢;并用16SrDNA方法分析,该菌株与吉氏芽孢杆菌DSM 8722(Bacillus gibsonii DSM 8722)的序列相似性为99%,因而鉴定其为吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)。 对吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)S-2菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件优化表明:甜菜渣是最适碳源和酶的诱导物,酵母膏为最适氮源;最佳固体培养基的组成为:甜菜渣5g,酵母膏0.15g,Na_2CO_3 0.09g,KH_2PO_4 30mg,MgSO_4·7H_2O 27mg,水15mL;对吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)S-2的培养条件进行优化的结果为:种龄为24h,接种量2ml,培养温度35℃,发酵周期48h。在此条件下产酶率为3700u/g。 对发酵后酶的提取工艺研究表明:用30倍体积的的Na_2CO_3/NaHCO_3(pH10.5)缓冲液浸提1h,酶收率最高。该酶的最适pH为10.5,最适反应温度为60℃;酶的pH稳定性实验结果表明55℃水浴保温30min后,该酶在pH9.0—pH10.5范围内较稳定;酶的热稳定性实验结果表明:在35℃时,酶可以长时间保持活力,大于55℃时,酶的活力损失很快。金属离子Ca~(2+)、Mg~(2+)和表面活性剂Tween80、Tween60、Tween20、SDS对酶都有明显的激活作用。 碱性果胶酶粗酶液经微滤、超滤、硫酸铵盐析、Sephadex—G25柱层析、阴离子交换纤维素Express-ion D柱层析、Sephadex—G100柱层析,分离纯化,得到两种均一组分,分别为聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶。经SDS—PAGE电泳,得出这两种酶的分子量都为41KD。


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