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聚噻吩纳米粒子的制备与pH传感及细胞成像研究

刘立霞  
【摘要】:细胞内pH值(pH_i)在许多生理和病理过程中扮演着非常重要的角色。典型的哺乳类动物细胞内pH值在4.5-8.0范围内,而不同细胞器内pH值又有所不同,例如细胞质基质中pH_i通常在6.8-7.4,而溶酶体、线粒体中pH值则分别约为4.5和8.0。轻微的pH_i值变化可以反映出细胞的状态和代谢过程。此外,大量的研究已经表明,细胞的高酸度往往与许多疾病相关。因此,细胞内pH值的准确测量和可视化成像对生物学研究和临床诊断具有重要意义。荧光探针技术具有灵敏度高,操作简单,信噪比高,良好的时空分辨率等优势,已经成为细胞内pH值测定的有效分析手段之一。目前已有大量的pH荧光探针被报道了,这些探针主要基于小分子荧光染料如荧光素、花菁和芘等的衍生物。这些探针通常存在水溶性差、光稳定性差的缺点,无法对细胞内pH值的变化进行长时间的追踪和观察。因此发展其它的pH探针体系是非常必要的。共轭聚合物具有强的光捕获能力和倍增光学响应性,为各种生物活性物质的传感和成像提供了新的材料体系。本论文设计合成了一种聚噻吩衍生物(PTNEt_2),其结构特征在于聚噻吩骨架为荧光报告基团,侧链二乙氨基为pH响应性基团。该聚合物几乎不溶于水,但其质子化的产物易溶于水。利用这一性质,一种新颖的基于pH依赖性的共轭聚合物纳米粒子组装-解组装pH传感策略被提出了,其pH检测原理如下:分散在水中的PTNEt_2纳米粒子(PTNPs)由于聚集诱导的荧光淬灭,其溶液几乎不发射荧光。随着pH的降低,PTNPs中的PTNEt_2上的二乙氨基被质子化,聚合物链间由于静电斥力而使纳米粒子解组装,体系的荧光恢复。相反,随着pH的升高,PTNEt_2上的二乙氨基去质子化,变为非水溶性的聚合物,而重新组装成纳米粒子,体系的荧光淬灭。本论文的主要工作如下:(1)共轭聚合物纳米粒子PTNPs的制备及其稳定性研究。(1)首先合成了共轭聚合物PTNEt_2,利用NMR确定了其化学结构。(2)然后,利用再沉淀方法制备了PTNEt_2纳米粒子(PTNPs),采用TEM,DLS分别表征了纳米粒子的形貌和水合直径,考察了聚合物浓度对纳米粒子粒径和形貌的影响。结果表明:聚合物形成了类球形的纳米粒子,随着聚合物浓度的增加,纳米粒子粒径增加,稳定性减弱。聚合物浓度为1 mg/mL制得的聚合物纳米粒子稳定性较好,浓度适宜,其水合直径约为193 nm。(3)最后,利用动态光散射(DLS),系统研究了静置时间、pH值、细胞中常见生物活性物质等因素对纳米粒子稳定性的影响。(2)纳米粒子PTNPs对pH的响应性及细胞成像。利用紫外吸收光谱、荧光发射光谱详细研究了纳米粒子PTNPs对pH的响应性。将纳米粒子分散在pH=8.0的水溶液中,逐渐向该溶液中加入0.1 M乙酸,使体系的pH逐渐降低到4.0。紫外滴定光谱结果表明,随着体系酸度的增强,紫外光谱中约515 nm,550 nm,595 nm处纳米粒子的聚集特征吸收峰逐渐蓝移到约438 nm,溶液颜色由紫色逐渐变为淡黄色。而其荧光发射光谱则表明:随着体系pH值的降低,荧光强度逐渐增加。根据荧光强度随pH值变化的关系曲线,可得纳米粒子的pKa约为5.71(R~2为0.9979)。当在pH=4.0的体系中逐渐加入0.1 M Na_2CO_3水溶液,使体系的pH值逐渐恢复到8.0,光谱滴定结果如下:随着体系碱度逐渐增强,溶液的荧光强度逐渐减弱,而约438 nm处的紫外吸收峰则逐渐红移到约515 nm,550 nm,595 nm。与其它金属离子相比,只有H~+的加入引起了PTNPs显著的荧光强度变化,证明了PTNPs对pH具有良好的选择性。MTT实验结果表明PTNPs的细胞毒性低,显示出良好的生物相容性。pH值依赖性的细胞成像实验表明,纳米粒子的荧光强度与细胞内pH值的变化呈良好的线性关系(Y=2.4506-0.3077X,R~2=0.9966)。因此PTNPs有望用于细胞内pH的定量检测。


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