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脑脊液对内源性神经干细胞增殖分化影响的实验研究

李青  
【摘要】:脊髓损伤是脊柱骨折的严重并发症,是困扰临床医生的一大难题。人类神经干细胞的分离、培养成功,为脊髓损伤的治疗提供了一条新的思路,使脊髓损伤恢复变为可能。神经干细胞已经有成熟的体外培养体系,但是,如何将体外培养的神经干细胞移植于体内存活且生长,代替损伤组织重建损伤的脊髓,恢复脊髓神经功能,仍有很多复杂的技术间题未能解决。在成年哺乳动物脊髓的室管膜、膜下区存在内源性神经干细胞,并且在脊髓损伤后出现大量反应性增生。当脊髓损伤后,通过对内源性神经干细胞的定向分化调控,使其迅速分化为神经元或再髓鞘化的少突胶质细胞,代替损伤脊髓组织来重建损伤的脊神经,形成神经通路,恢复脊髓功能,是脊髓损伤治疗的理想方法。脑脊液有营养和保护脑与脊髓的作用,其化学成分与脑脊髓组织细胞外液的成分大致相同。已有研究发现,神经干细胞能在脑脊液中均能存活、增殖和分化;向侧脑室中注射神经生长因子可使损伤的脑组织中内源性神经干细胞增殖加快并向神经元分化;脑脊液对神经元的形成及神经干细胞增殖分化起重要作用。 本实验第一部分研究成年大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞的增殖、分化规律。通过选用成年健康Wistar大鼠42只,随机分为正常对照组(A组,n=14)和脊髓损伤组(B组,n=28)。利用动脉瘤夹压迫法建立脊髓损伤动物模型,于伤后1天、3天、1周、2周、3周、4周、8周进行取材,观察局部病理组织学改变及用免疫组织化学方法检测局部脊髓组织在不同时段Nestin(?)勺阳性表达变化。结果发现A组只有极少数室管膜细胞胞浆内Nestin表达阳性,且在不同时间段Nestin表达无明显变化。B组脊髓组织中Nestin于损伤后1天时有少量表达;3天时室管膜细胞Nestin表达明显升高,1周达到高峰,与A组比较差异具有显著性(P=0.000);2周时开始下降,4周时很少有Nestin表达,8周时两组Nestin的表达差异无显著性(P0.05)。说明正常成年大鼠脊髓组织中存在有内源性神经干细胞,其主要存在于脊髓中央管周围的室管膜及膜下区。当脊髓损伤后这些内源性神经干细胞表达明显增加,在损伤原位增生、分化,但随着时间的推移内源性神经干细胞逐渐减少。 本实验第二部分探讨经侧脑室向脑脊液中注射碱性成纤维细胞生长因子或/和骨形成蛋白-2后,大鼠脊髓损伤部位内源性神经干细胞的增殖分化情况,了解脊髓损伤后脑脊液成分的改变对内源性神经干细胞增殖分化的影响,为脊髓损伤的治疗提供新方法。具体方法为选用成年健康Wistar大鼠60只,利用动脉瘤夹钳夹压迫法建立脊髓损伤动物模型。将其随机分为4组:按分组通过脑室向脑脊液中注射不同物质,A组注射生理盐水作为对照组;B组注射骨形成蛋白-2;C组注射碱性成纤维细胞生长因子;D组注射骨形成蛋白-2和碱性成纤维细胞生长因子组。于脊髓损伤后1周、2周、3周、4周、8周进行取材,将脊髓组织进行免疫组织化学方法检测,观察并比较各组大鼠损伤脊髓组织中在不同时间段BrdU及Nestin的阳性表达变化情况。实验结果发现在脊髓损伤后1周时,各组脊髓组织中BrdU(?)日性细胞数的表达差异无显著性(P0.05);在脊髓损伤后2周时,A组损伤脊髓组织中BrdU开始下降,B、C、D三组损伤脊髓组织中BrdUP日性细胞数进一步增多;在脊髓损伤后3周时,A组脊髓组织中BrdU染色阳性细胞明显减少,B、C、D组中BrdU阳性细胞达到高峰,与A组比较差异具有显著性(P=0.000);在脊髓损伤后4周时,B、C、D三组损伤脊髓组织中BrdU阳性细胞数开始减少;在第8周时,A组中BrdU几乎无表达,B、C、D三组中BrdUP日性细胞数仍有少量表达,与A组比较差异无显著性(P0.05)。脊髓组织中Nestin阳性细胞数的表达,在脊髓损伤后1周时,各组差异无显著性(P0.05);在脊髓损伤后2周时,A组损伤脊髓组织中Nestin开始下降,B、C、D三组损伤脊髓组织中Nestin阳性细胞数进一步增多;在脊髓损伤后3周时,B、C、D组中Nestin阳性细胞达到高峰;在脊髓损伤后4周时,B、C、D三组损伤脊髓组织中Nestin阳性细胞数开始减少,B组中下降的更明显;在第8周时,A组中中NestinP日性细胞几乎无表达,B、C、D三组中BrdU阳性细胞数仍有少量表达,与A组比较差异具有显著性(P=0.000)。 我们实验结果说明成年Wistar大鼠脊髓损伤后,在脑脊液中加入碱性成纤维细胞生长因子和(或)骨形成蛋白-2,损伤脊髓组织中内源性神经干细胞明显增多,说明碱性成纤维细胞生长因子和骨形成蛋白-2能够促进脊髓内源性神经干细胞的增殖和分化。脊髓损伤后通过改变脑脊液的成份会对脊髓内源性神经干细胞增殖和分化产生影响。


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