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基于抗原表位分析的妊娠相关血浆蛋白A的克隆表达及其临床诊断应用研究

曾昭伟  
【摘要】:目的: 针对妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A) CDS区的特定抗原表位,利用重组克隆技术,制备PAPP-A重组蛋白,利用这种抗原蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,在此基础上制备酶标记抗体以及生物素化抗体。建立一种针对PAPP-A的高灵敏度酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法,制备相关的试剂盒,在临床上应用于产前筛查唐氏综合征(Down syndrome, DS)和急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS),指导相关疾病的诊治。 方法: 1.借助于DNAstar软件,分析PAPP-A的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编码区。 2.从新鲜胎盘组织中提取总RNA,反转录并PCR生成PAPP-A编码区的DNA;另一方法是购买PAPP-A-质粒转化菌种制备DNA。 3. PAPP-A的DNA和pET42a质粒分别双酶切,凝胶回收之后连接,转化Top10大肠杆菌,筛选阳性克隆鉴定正确后,转化BL21大肠杆菌,诱导产生PAPP-A重组蛋白。利用镍柱纯化。 4.制备的重组蛋白注射家兔,制备抗PAPP-A抗体。并用金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法纯化PAPP-A抗体。 5.抗原的纯化。足月孕妇血清依次用免疫亲和层析法,离子交换法以及分子筛法纯化。 6.用辣根过氧化物酶(HRP)和生物素(Biotin)标记PAPP-A抗体并且优化反应条件。 7.将以上的方法进行灵敏性、重复性、稳定性等的方法学评价。 8.用灵敏以及超敏感试剂盒检测相关DS、ACS标本。 结果: 1.利用DNAstar软件,结合对PAPP-A序列信号肽位置的预测,疏水性、二级结构,结果表明碱基序列1-309bp带有信号肽,这一区段表达的重组蛋白能够自由进出细胞膜,易于分泌到血液中。 2.本研究购进转化入细菌的PAPP-A基因质粒,结果成功从扩大培养的细菌中得到DNA。 3.按照常规的制备重组蛋白的方法,成功制备PAPP-A重组蛋白。 4.利用制备的PAPP-A重组蛋白注射新西兰家兔2只,得到PAPP-A抗体,利用琼脂双向凝胶扩散测定效价,达到1:16。 5.将抗体连接在凝胶上,装在柱子中,制成免疫层析柱。 6.酶标抗体的制备采用过碘酸钠法。得到的即为标记酶。测定酶的量:1.2mg/mL,生物素化也成功制备。 7.足月孕妇血清经过亲和层析,离子交换以及分子筛层析之后,在SDS-PAGE检测的条带中呈现较为单一的条带,效果良好。 8.检测不同孕期孕妇是否有DS。BA-ELISA方法的建立在检测第一二孕期是否有DS患儿有较大的临床价值。我们制备了高灵敏的检测ACS患者的BA-ELISA试剂盒同样发现有较大临床应用价值。 结论: 本研究有针对性的制备PAPP-A重组蛋白,可以避免了其他抗原表位的干扰,使得抗原蛋白特异性增强,并且重组蛋白能够较为容易得到。通过注射家兔制备了相应的抗体,经过一系列层析之后,可以用于连接生物素以及辣根过氧化物酶。成功制备BA-ELISA检测体系。 本研究灵敏度等方法学评价指标均良好。成功用于检测不同孕期的胎儿状况检测,并且可以用于检测ACS患者。BA-ELISA方法提供了临床上快速、准确、方便检(?)PAPP-A的工具,使得PAPP-A的检测的临床应用价值较大。


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