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Cid/Lrg调节系统对表皮葡萄球菌临床株生物被膜形成的调控机制的研究

王荔  
【摘要】:表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE简称表葡菌)是重要的条件致病菌,也是医院内感染重要病原体之一。表葡菌致病性与生物被膜形成密切相关,近年来有关细菌生物被膜的研究认为,cid和lrg调节的细菌细胞死亡和溶解以及细胞外DNA (eDNA)的释放,对细菌生物被膜的形成和稳定十分重要。因此,体外干预细菌程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)可能为控制细菌生物被膜感染开拓新的思路。本研究以表葡菌临床株为研究对象,探究表葡菌生物被膜形成的分子调控机制;分析eDNA水平的差异对表葡菌临床株生物被膜形成能力的影响;观察葡萄糖、泵抑制剂(CCCP)和奥美拉唑对表葡菌临床株生物被膜的影响并探讨可能的机制,为临床由多途径防控生物被膜相关感染提供依据。 目的 ①了解表葡菌临床株生物被膜形成能力,分析cidA和lrgA基因表达水平及其上游调控基因与生物被膜形成的关系。 ②探讨eDNA水平的差异对表葡菌临床株生物被膜形成能力的影响。 ③探讨葡萄糖、泵抑制剂(CCCP)和奥美拉唑对表葡菌临床株生物被膜的影响及可能的机制。 方法及内容 ①收集表葡菌临床株227株,进行黏附试验和icaA基因片段的PCR扩增,黏附试验和icaA基因均阳性的表葡菌临床株入成膜组,黏附试验和icaA基因均阴性的表葡菌临床株入非成膜组。 ②PCR扩增表葡菌临床株cidA和lrgA基因片段,半定量RT-PCR分别检测表葡菌临床株cidA和IrgA mRNA水平,计算cidA与lrgA mRNA比率,比较成膜组与非成膜组菌株的差异。半定量RT-PCR检测成膜组表葡菌Y36和非成膜组表葡菌Y26在不同时点的cidA和lrgA mRNA水平。 ③PCR扩增表葡菌临床株cidA和lrgA上游的调控基因cidR和lytSR基因片段并进行序列分析,通过BLAST比对,比较成膜株Se82与非成膜株Y80的cidR和lytSR基因片段的差异。 ④采用浮游培养法和微量板静置培养法检测eDNA水平,比较成膜组与非成膜组表葡菌eDNA水平的差异,分析其与生物被膜形成的相关性。 ⑤采用置片法静置培养生物被膜,在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察eDNA的数量和分布。 ⑥分别采用半定量RT-PCR法、微量板静置培养法和粘附试验分析表葡菌成膜株与非成膜株在35mM葡萄糖和100μMCCCP干预后的cidA和lrgA mRNA水平、eDNA水平和生物被膜形成能力。 ⑦采用微量肉汤稀释法分别检测奥美拉唑和12种常用抗菌药物单用和联用时的MIC。分别采用半定量RT-PCR法、微量板静置培养法和粘附试验分析表葡菌成膜株与非成膜株在不同浓度(25,50,100,200g/m1)奥美拉唑干预后的cidA和lrgA mRNA水平、eDNA水平和生物被膜形成能力。 结果 ①分组结果:227株表葡菌临床株中,26株粘附试验阳性,阳性率11.5%;32株携带icaA基因,阳性率14.1%。依据黏附试验和icaA基因扩增结果,选取成膜组菌株20株,非成膜组菌株19株进行研究。 ②cidA和lrgA基因扩增及mRNA水平:成膜组20株和非成膜组19株均可扩增出345bp的cidA基因片段和446bp的lrgA的基因片段。培养4h成膜组和非成膜组的cidAmRNA相对水平分别为0.340±0.250和0.406±0.408(P=0.541),lrgAmRNA相对水平为0.325±0.218和0.253±0.211(P=0.299),两组比较差异均没有显著性。成膜组和非成膜组cid/lrgmRNA比率分别为1.067±0.529和1.958±1.877,两组总体分布差异有显著性(P=O.001)。 ③不同时点的cidA和lrgA mRNA水平:在培养2、4、6、8、10h后,成膜株Y36和非成膜株Y26cidAmRNA均在4h达到高峰,相对灰度值分别为0.105和0.023;lrgAmRNA均在6h最高,相对灰度值分别为0.521和0.562。 ④cidR和lytSR基因扩增及序列分析:成膜组20株和非成膜组19株均可扩增出422bp的cidR基因片段和497bp的lytSR基因片段。与基因库中RP62A和ATCC12228等2株菌相应片段相比,成膜株Se82的cidR扩增片段的同源性均为100%,lytSR扩增片段的同源性分别为100%和99%;非成膜株Y80的cidR扩增片段同源性均为99%,lytSR扩增片段同源性均为98%。 ⑤eDNA水平的检测:成膜株Y36浮游培养2、4、6、8、10h后,各时段eDNA水平均高于非成膜株Y26。浮游培养2、4、6h后,20株成膜组表葡菌的eDNA水平分别为32.2±10.1(μg/m1),33.6±11.9(μg/m1),34.3±10.0(μg/m1),19株非成膜组表葡菌的eDNA水平分别为28.7±8.9(μg/m1),31.5±11.7(μg/m1),31.8±12.7(μg/m1)。成膜组菌株各时段eDNA水平分别高于非成膜组菌株,但差异无显著性(PO.05)。微量板静置培养法测基质中的eDNA水平,20株成膜组表葡菌为740.0±264.4(ng/OD600),高于19株非成膜组表葡菌80.1±31.1(ng/OD600),两组之间差异具有显著性(P0.05)。 ⑥eDNA分布:通过AO-PI染色于荧光显微镜和CLSM下观察静置培养的表葡菌成膜株Y36,其生物被膜中可见eDNA分布;非成膜株Y26没有生物被膜结构形成,未见eDNA分布。 ⑦葡萄糖干预试验:成膜组6株表葡菌Se60,Se82,Y34,Y36,Y65,Y78与非成膜组3株表葡菌Y77,Y21,Y22在35mM葡萄糖干预后,cidA和lrgA mRNA水平均升高;eDNA水平均升高;黏附试验A570值均升高且成膜株升高趋势较明显。 ⑧CCCP干预试验:成膜组6株表葡菌Se60,Se82,Y34,Y36,Y65,Y78与非成膜组3株表葡菌Y77,Y21,Y22在100μMCCCP干预后,lrgA mRNA水平均升高,cidA mRNA水平无明显变化;eDNA水平均下降;黏附试验A570值均下降,且成膜株eDNA水平和黏附试验A570值下降趋势较明显。 ⑨奥美拉唑干预试验:奥美拉唑在800μg/ml时对表葡菌成膜株Y34和非成膜株Y21的生长仍无明显抑制。药敏试验显示,联合25,50,100μg/ml奥美拉唑,12种抗菌药物对表葡菌Y34和Y21的MIC均无影响;联合200μg/ml奥美拉唑时,环丙沙星和左氧沙星对两株表葡菌的MIC均下降2倍,对其余10种抗菌药物的MIC仍无影响。25,50,100μg/ml奥美拉唑干预后,两株表葡菌的lrgA mRNA水平均升高,cidA mRNA水平无明显变化;200μg/ml奥美拉唑干预后,两株表葡菌的cidA和lrgA mRNA水平均明显下降。25,50,100,200μg/ml奥美拉唑干预后,两株表葡菌的eDNA水平均下降且成膜株Y34的下降趋势较明显;两株表葡菌黏附试验A570值均有所下降。 结论 ①cidA和IrgA基因是表葡菌重要的结构基因,两基因表达均具有一定时限性;cidA和lrgA趋于平衡的协调表达对生物被膜形成和稳定十分重要,cidAllrgA mRNA比率可能是决定表葡菌形成生物被膜的指标,具有一定的生物学意义。 ②cidA和lrgA存在上游的调控基因cidR和fytSR;表葡菌生物被膜可能受多个调控系统共同作用,有待进一步深入研究。 ③eDNA作为基质成分,对表葡菌生物被膜形成具有重要作用。 ④微量板静置培养法检测eDNA水平优于浮游培养法,可判断表葡菌临床株是否能够形成生物被膜。 ⑤35mM葡萄糖可增强cidA和lrgA基因转录,升高eDNA水平,促进表葡菌生物被膜的形成。 ⑥100μMCCCP可增强lrgA基因转录,降低eDNA水平,抑制表葡菌生物被膜的形成。 ⑦200μg/m1奥美拉唑体现出外排泵抑制作用,可提高氟喹诺酮类药物的抗菌能力。奥美拉唑在一定浓度下可增强lrgA基因转录,降低eDNA水平,使表葡菌生物被膜形成能力有下降趋势,为临床抗生物被膜感染治疗开辟了良好的前景。


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